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DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media)이란?

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수민 오

on 14 April 2014

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Transcript of DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media)이란?

DMEM은 가장 일반적으로 사용되는 animal cell culture용 media 이다. 즉, 동물 세포 배양용 배지이다.
세포배양시 DMEM만 놓고 보면
아미노산, 비타민, 무기 염분, 포도당,
지질, 그리고 지시약
이 들어간다. 그리고 세포를 배양 하기 위해
혈청을 10%
정도 넣어주어야 한다.
(혈청에는 기타 생명이 유지 되는데 필요한 호르몬이나 성장요소들을 포함한다. 혈청은 종류가 다양하다. 하지만 주로 송아지의 혈청이나 태반에 있는 송아지로부터 나온 혈청을 사용한다.)
그 후 중요하게 들어가는 것이 항생제이다.
주로 페니실린/스트렙토마이신/
젠타마이신
/암포테라신 B등이 쓰인다.
DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media 이란
실험 목적
우리가 원하는 미생물을 대량 배양하기 위해서는 배지가 필요하다.
배지는 미생물에 따라 온도, 습도, 빛의 세기등이 달라지는데 이번 실험에선 Hirc-B cell에 맞는 배지를 만든다
Cell Culture Preparation

1. DMEM 배지 만들기

2. PBS(Phosphate Buffer Solution)만들기

DMEM 배지의 조성
1. Bulk ions - Na, K, Ca, Mg, Cl, P, NaHCO3
2. Trace element – iron, zinc, selenium
3. Sugars – commonly Glucose
4. Amino acids
5. Vitamins
6. Serum

Neutralize
- trypsin and other proteases

Healthy growth
– growth hormones
7. Antibiotics
Although not required for cell growth, but used to control the growth of bacterial and fungal contaminants(세포 성장에 관여X, 그러나 박테리아,곰팡이등의
오염방지
)

FBS(Fetal Bovine Serum)
Fetal bovine serum(FBS)는 소 태아 혈청이라고한다.

혈청이란 혈액 중에서 혈구와 섬유소원(피브리노겐)을 제거한 액체성분으로 소 태아의 혈액에서 추출한 성분이다.


DMEM을 알아볼까요?
이제 FBS를 알아봅시다
①세포의 성장과 기능에 관여하는
호르몬 제공
②세포의 부착과 확산인자 제공
③호르몬, 중금속, 지질 등의 운반
단백질 제공
④증식 환경에 있는 독성 성분에
부착 및 중화
세포 배양에서 혈청의 역할
혈청의 성분

①단백질: 세포배양에 유용하다고 알려진 단백질로는
알부민과 글로빈, 세포부착을 촉진시키는 피브로넥틴,
트립신을 억제하는 a2-macroglobin 등이 있다.
②polypeptide: PDGF는 세포증식 촉진능력을 가지고 있는
polypeptide군 중 하나인데, 이것이 혈청내의 주요 성장인자로
사용된다.
③호르몬: 혈청에 존재하는 성장호르몬이 성장인자(IGF)와 연계
하여 세포증식을 촉진시킬 수있다.
④각 종 영양소와 대사물질
⑤각종 무기질
⑥억제인자


혈청의 종류
-우태혈청(FBS:Fetal Bovine Serum)
: 보편적인 세포증식에 사용되는 혈청
-우아혈청(BCS:Bovine Calf Serum)
: 우태혈청을 필요로 하지 않는 몇몇 세포주 배양에 사용

시약 및 사용 기구
water bath, Laminar flow hood(clean bench), CO₂ Incubator, Culture dishes, 3.7g sodium bicarbonate, DMEM powder, MTX, gentamicin, 10% FBS, 0.2 microns 이상을 걸러 주는 filter, mass silinder, ddH₂O와 비커, 70% 에탄올, NaHCO₂, Bulk ions, pH meter, Trace elements, sugers, amino acids, vitamins, serum, 피펫
실험 과정
1. 교반기 위에 비커를 두고 ddH₂O 800㎖와 마그네틱바를 넣고 돌린다.



2. DMEM medium powder 1 pack을 넣어준다.

3. 이 solution에 3.7g sodium bicarbonate를 넣어준다.

4. PH meter를 사용하여 solution의 pH를 7. 4 가 아닌 7.2로 맞춰준다.

5. 15min뒤 0.5%의 Antibiotics(gentamicin)(즉, 5㎖)를 넣고, ddH2O로 메스실린더에
final volume 1L를 맞춰준다.
6. pH meter로 pH를 맞춘다.(색깔변화관찰 미세하나 체리색)
7. 이 solution에 200㎕ MTX (Methotrexate)를 넣어준다.


8. 10% 혈청(FBS) 100㎖(50㎖짜리두개) Water bath후 넣어준다.

9. 완성된 solution에 filter를 꽂고, filteration후 Labeling

800㎖ 넣는 이유 : 전체 volume의 80%를 넣어야 하기 때문
ddH₂O를 넣는 이유 : 일반 물은 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 멸균된 물을 사용
pH 변화에 따른 정량실험이므로 파우더의 가루도 남지 않도록 깔끔히 넣어야 한다.
CO₂ incubator에서 키우는 이유와 동일
filteration 할 때 pH가 0.2만큼 상승하기 때문
MTX 역할 : Nucleotid를 합성하지 못하게 함, 인슐린 과발현을 일으킴
100nM MTX를 500μM Stax짜리를 1L에 넣으려면?
계산방법
1. 마이크로몰을 나노몰로 환산한다.
500μM = 0.5mM = 500000nM
2. 비율구하고 기준 1L당 얼마를 넣어야 하는지 구한다.
100nM / 500000nM = 1 / 5000 이니까
3. 기준 1L를 마이크로리터로 환산
1L = 1000ml =1000000㎕
4. 1000000㎕당 1 / 5000 의 비율로 들어가야 하니까
200㎕를 넣으면 된다

실험조, 첨가물질, 날짜 등
Labeling 꼭 하기

실험 목적
DMEM media 의 pH를 유지시키는 PBS를 만들기 위함이다.

① PBS는 완충용액으로의 역할. 완충용액은 우리 몸에서
급격한 pH변화를 조절.
급격한 pH변화는 Protein의 기능에 영향을 줌
② 이온의 세기 맞춰줌. 몸의 세포는 삼투막이므로
이온농도가 높아지면 세포가
파괴될수도 있으므로 이를 도와줌

PBS기능


1. pH유지, 세포구조유지, 완충용액,
waxing 용액
2. 배지 안 물질들과 반응을 하면 안 됨
3. Cell 성장에 방해 하면 안 됨

PBS역할 및 조건

Phosphate Buffer VS Phosphate Bufferd Solution

PB는 Phosphate성분만 넣고 pH조절
PBS는 Phosphate외에 salt가 들어있음
즉, PBS는 PB+NaCl(염)


ddH2O, DPBS powder 1 pack, CaCl2 , Antibiotics(gentamycin)
Bottle top filter, 1L bottle

실험 기구 및 시약

1. 1L bottle에 800㎖ ddH₂O 넣는다.
2. DPBS powder를 넣는다.


3. 이 solution에 CaCl2 넣는다.
4. 15min뒤에 5㎖ gentamycin를 넣고 final volume을 맞춘다.
5. DMEM과 마찬가지로 Filteration시킨 후 Labeling

물 온도는 15~20도
실험 과정
열을 가하면 안 된다
단백질 변형이 일어날 수 있기 때문이다.
남은 가루 없이 pipet으로 완벽하게!
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