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2016-Familia Adenoviridae

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Transcript of 2016-Familia Adenoviridae

photo (cc) Malte Sörensen @ flickr
Adenoviridae
Clasificación filogenética
Estructura del virión
Estructura del genoma
Ciclo replicativo
Variabilidad genética
Interacciones con el Hospedero
Adenovirus como vector
Introducción
Virus de ADNds lineal, no envueltos, de cápside icosaédrica, que replican en el núcleo celular
Diámetro 70-90nm
Infectan tanto animales como humanos (variedad de infecciones: respiratorias, gastroenteritis infantil, conjuntivitis)
Se aislaron por primera vez en 1953 a partir de un cultivo de células adenoides
Vías de transmisión: por contacto directo y fecal-oral
Actualmente (ICTV 2015) se conocen 50 especies de las cuales 7 infectan humanos (Human mastadenovirus A-G). A su vez, éstas se clasifican en diferentes tipos (alrededor de 60) basándose en serología, hemaglutinación, oncogenicidad en roedores, transformación de células primarias y secuenciación del genoma.
Árbol filogenético a partir de la secuencia AA del hexón (Harrach et al. 2011, 9th Report ICTV)
Relación filogenética entre Adenovirus humanos obtenida a partir de la secuencia del gen del hexón. (Geisbert et al. 2011)
5 géneros:
1) Mastadenovirus (27spp) Mamíferos (incluidos los humanos)
2) Aviadenovirus (12spp) Aves
3) Atadenovirus (5spp) Genoma sesgado a alto contenido A+T
Aves, reptiles, rumiantes, marsupiales
4) Siadenovirus (5spp) Aves y reptiles
5) Ichtadenovirus (1spp) Esturiones (2009)
No envueltos
Estructura icosaédrica
Genoma de ADN doble cadena de 26-45 Kb



Cápside compuesta por 252 capsómeros:
-
240 hexones
-
12 pentones
(pentón = base + fibra) en los vértices
Proteínas menores de la cápside:
IIIa
,
VIII
y
IX





Genoma viral posee un polipéptido terminal (
TP
) unido covalentemente al extremo 5' del genoma (2 copias) - Función: Primer para replicación.
Polipéptidos
V
,
VII
(proteína principal del core)
y

Mu
son básicos y ricos en Arginina lo cual los hace adecuados para asociarse no covalentemente al ADN formando una estructura "
chromatin-like
"
La proteína
VI
se asocia con la superficie interna de los hexones y con la proteína V.
IVa2
se une a la secuencia de encapsidación en el extremo izq del genoma
p23 cisteín-proteasa
CÁPSIDE
CORE:
proteínas + DNA
ADNdc
lineal no segmentado de 26-45Kb
Posee
repetidos invertidos
en sus extremos que funcionan como origen de replicación
Las secuencias que codifican para las proteínas estructurales, y aquellas involucradas en la replicación y el ensamblado se encuentran altamente conservadas entre los diferentes géneros.
Por el contrario, genes que codifican proteínas reguladoras son más variables entre géneros.
Los genomas de los adenovirus humanos poseen además varios repetidos de una
secuencia de encapsidación
que actúa en
cis
. Se localiza entre el repetido terminal izq. y la primer región codificadora de E1A.
5 unidades de transcripción temprana E1A, E1B, E2, E3 y E4
4 unidades de transcripción temprana retrasada (IX, IVa2, L4 intermedia y E2 tardío)
1 unidad de transcripción tardía que origina 5 familias de mensajeros tardíos (L1 - L5)
IX
IVa2
E2A tardío
Recombinación homóloga
- ocurre con alta eficiencia durante el crecimiento en cultivos co-infectados, y hay evidencia que sugiere que también sucede en la naturaleza.
- requiere la replicación del ADN y probablemente resulte de la hibridación de ADNsc o bien de la invasión de ADNsc a una hebra de ADN duplex.
El ciclo replicativo ocurre en el núcleo
Se divide en 2 fases:
-Temprana
-Tardía (comienza con la replicación del ADN)
Comienza cuando el virus interactúa con la célula hospedera
Incluye: unión, penetración, movimiento de las partículas virales al complejo del poro nuclear, transporte del ADN al núcleo y expresión de genes tempranos
Replicación del ADN
Expresión de genes tardíos
Ensamblado de la progenie viral
Distinción funcional no tan clara: los genes tempranos continúan expresándose tardíamente y el promotor que controla la expresión de la unidad tardía de transcripción dirige un nivel basal de expresión al comienzo de la infección
coxsackie B virus and adenovirus receptor
3 Objetivos principales:
- Inducir a la célula a entrar en la fase S del ciclo celular (E1A y E4)
- Configurar sistemas virales que protejan la célula infectada (E1B y E3)
- Sintetizar productos génicos virales necesarios para la replicación del ADN (E2)
Por Splicing alternativo se generan diferentes mRNAs a partir de un mismo transcripto
Vacunas
Existen vacunas orales efectivas a virus vivos no atenuados (serotipos 4 y 7), con cubierta entérica, que atraviesan el epitelio respiratorio y sólo replican en el intestino. Esto genera una infección asintomática del tracto gastrointestinal, lo que resulta en una buena respuesta de anticuerpos neutralizantes.
Estas vacunas fueron suministradas a personal militar por 25 años con excelente eficacia y seguridad pero se discontinuó su producción en 1996.
En 2011 se aprobó nuevamente para uso en personal militar, pero aún no está aprobada para uso en civiles y niños debido a los riesgos de transmisión clínica entre contactos.
Los adenovirus son ideales para su uso en terapia génica debido al tamaño de su genoma que teóricamente permite la transferencia de grandes fragmentos de ADN

Propiedades de los vectores adenovirales
:
1) un
tropismo muy amplio
, infectando numerosos tipos celulares;
2)
infectan
tanto
células quiescentes como células en división
;
3) expresan
altas cantidades del transgén
;
4) no requieren de integración en su ciclo infectivo y el material génico se expresa de
forma episomal
;
5) su
construcción, manipulación y producción
son relativamente
sencillas;
6) son virus
estables
y se obtienen títulos altos (10^11-10^15 pfu/ml);
7) no se han descrito patologías graves asociadas al adenovirus salvaje

La terapia génica consiste en la introducción de material genético en el interior de una célula diana con el objeto de producir en ella un cambio funcional que se traduzca en un efecto terapéutico.
Qué es la terapia génica?
En la mayoría de los casos, es necesario recurrir al empleo de un vehículo, denominado
vector
, para introducir el material genético en las células. Éstos pueden provenir de virus modificados genéticamente (
vectores virales
) o pueden ser formulaciones fisicoquímicas (
vectores no virales
)
El método general para la construcción de vectores virales consiste en la sustitución de elementos imprescindibles para la replicación, por el material génico que se desea transferir. De este modo se consiguen
partículas virales no replicativas pero infectivas
, y con capacidad para transferir el material génico terapéutico introducido en su genoma.
Región esencial para la transformación por adenovirus, tanto E1A y E1B son requeridas.

Son
Oncoproteínas virales.
Región E1
Región E3
Dos de sus proteínas bloquean el transporte de MHC-I a la membrana plasmática, previenen que células T citotóxicas destruyan la célula infectada e inhiben la lisis celular.
Región E4
Codifica 2 proteínas -
E4orf1
y
E4orf4
- que generan un aumento en la traducción de mensajeros celulares y virales.
Además la proteína
E4orf3
inhibe la respuesta al daño de ADN celular ya que se une a los extremos del genoma protegiéndolo. Asimismo, induce la metilación de la histona H3 de los promotores que son blanco de p53 consecuentemente inhibiendo su unión.
p53 es un factor de transcripción que activa genes que llevan al arresto del ciclo celular y a la apoptosis al detectar daño del ADN celular
La proteína Rb105, ejerce su efecto durante la primera parte de la fase G1 del ciclo celular. En este período o en las células quiescentes, esta proteína se une al factor de la transcripción e2F secuestrándolo y garantizando que la fase S no pueda ser iniciada.
Virología Molecular
2016
MSc. Natalia Echeverría

Oncogénesis
Los adenovirus humanos son capaces de causar oncogénesis en roedores pero
no en humanos
. Basados en su capacidad de generar tumores en animales, los HAd se clasifican en altamente oncogénicos, débilmente oncogénicos o no oncogénicos.
Transformación vs Oncogénesis
la
transformación
ocurre en los cultivos celulares
la
oncogénesis
(desarrollo de cáncer) ocurre en animales y requiere cambios adicionales
Una célula transformada puede no ser oncogénica
Para que un virus transforme una célula se necesita que:
1)
Se disminuya el efecto citopático
de modo de que la célula no muera
2)
Se reduzca o elimine la replicación viral
de manera que no se produzcan viriones
3) Que la célula continúe dividiéndose, es decir que
se vuelva inmortal
En algunos casos, las células transformadas contienen parte del
genoma viral integrado
en el genoma de la célula hospedero. En células transformadas por adenovirus la integración es el resultado de reacciones de recombinación entre secuencias de DNA generalmente no relacionadas, pero este evento se da en
muy baja frecuencia
.
Desde un punto de vista teórico, los vectores adenovirales
pueden resultar tóxicos
por tres razones:
1) Si contienen cantidades apreciables de adenovirus con capacidad replicativa, generados durante la producción por recombinación entre secuencias del vector y secuencias homólogas de las células permisivas;
2) Si contienen cantidades apreciables de proteínas virales no eliminadas durante el proceso de purificación;
3) Por la respuesta inmunológica innata y específica generada contra antígenos virales o contra el transgén, que puede generar un síndrome de hipercitoquinemia comparable al shock endotóxico

Temprana
Tardía
Dudas???
(Nemerow et al. 2009)
L4 interm.
5'
3'
3'
5'
Transcriptos por la RNA polimerasa II
A excepción de las unidades de transcripción IVa2 y IX, cada uno de los genes da lugar a múltiples mRNAs que se diferencian por Splicing Alternativo
En el caso de las unidades mayores de transcripción tardía L1 y L3 también se diferencian por sitios alternativos de poly(A)

La replicación del ADN es semiconservativa y continua desplazando la hebra complementaria; además de las proteínas virales requiere proteínas celulares. También ocurre replicación por medio de una estructura tipo "panhandle"
Ensamblado:
L4-100K actúa de chaperona para el plegamiento del hexón y como scaffold para el ensamblado de los pentones en el citoplasma.
Una vez formados se importan al núcleo donde el ADN será encapsidado.
IVa2 une ATP y funciona de motor para insertar el genoma en la cápside.
Liberación por
Lisis Celular
http://cronodon.com/BioTech/Adenovirus.html
Qué es una Oncoproteína?
Proteína expresada por un gen mutado o por un virus, que estimula la proliferación celular evitando los mecanismos de control de la división celular
Las proteínas de la unidad transcripcional
E1B
se unen a la proteína supresora de tumores
p53
.
Las proteínas de la unidad transcripcional
E1A
se unen a la proteína supresora de tumores
Rb105
(Retinoblastoma 105 kd)
Pero qué es la oncogénesis???
Y la transformación???
Características de células transformadas
Inmortales:
crecen y se dividen infinitamente
- producen telomerasa (enzima que mantiene el DNA telomérico en los extremos de los cromosomas)
- reducción en el requerimiento de factores de crecimiento
Perdieron la inhibición por contacto
: crecen apiladas y hasta altas densidades
Independientes de anclaje:
no necesitan una superficie en la cual adherirse para poder crecer
Características de células oncogénicas
Las características de células transformadas no son suficientes para la inducción de tumores.
La oncogénesis generalmente depende de la habilidad de las células transformadas de
sobrevivir ante las defensas del sistema inmunológico
.
En algunos casos también es requerida la
angiogénesis
(crecimiento de vasos sanguíneos) que lleven nutientes a las células tumorales
(Modificado de Fry y Wood, 1999)
(Khurana y Meyer, 2003)
(Horwood
et al.
2002)
(Coughlan
et al.
2010)
(Ryan, 2010)
http://ghr.nlm.nih.gov/
Traducción
- Cap- dependiente (mensajeros con Cap y cola poly A)
- Excepción: mensajeros tardíos se traducen por mecanismo alternativo (Ribosome shunting: cap-dependiente pero con escaneo discontinuo saltándose la secuencia líder tripartita en su región 5'NTR)
http://viralzone.expasy.org
Full transcript