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Extracción y purificación de proteínas

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Lo OL

on 4 December 2012

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Transcript of Extracción y purificación de proteínas

Extracción y purificación de enzimas Todas las enzimas son proteínas
En su extracción deben extremarse las precauciones para evitar la desnaturalización que conduce a la pérdida de actividad.
El material biológico debe homogeneizarse en un medio tamponado a un pH adecuado para desintegrar las células. Algunas enzimas son solubles :
Su obtención se realiza por precipitación fraccionada con sulfato amónico o disolventes orgánicos y refraccionamiento por técnicas cromatográficas.
En cada fase de purificación se determina la actividad enzimática de las fracciones y se rechazan las no activas , de éste modo , la fracción enzimática buscada cada vez más pura , alcanza su máxima actividad. criterios de pureza Electroforesis en gel , que nos dice el número de proteínas en cada fracción
Actividad enzimática alta y constante
Cristalización , cuando es posible. Otras enzimas están ligadas a partículas celulares y deben separarse por centrifugación y después aislarse. Separación de proteínas Las células se desintegran por frotamiento , agitación , ultrasonido , etc, en un medio extractor que es una solución salina tamponada con fuerza iónica y pH adecuados.
El producto desintegrado se centrifuga para separar los residuos celulares.
Para separar las proteínas que interesan , la mezcla extraída se fracciona por alguno de los siguientes métodos: Métodos basados en diferencia de solubilidad Las proteínas aumentan su solubilidad a concentraciones salinas bajas, y precipitan a concentraciones salinas altas.
El pH influye en la solubilidad: en el pI la solubilidad es mínima y la capacidad de cristalización es máxima. A pH extremos la solubilidad es máxima.
Las proteínas se precipitan a altas concentraciones de sales. La precipitación se basa en las diferencias de solubilidad se puede realizar una precipitación fraccionada con concentraciones crecientes de sales como:
Sulfato de amónico
Sulfato magnésico Separación de proteínas basadas en la carga Electroforesis: La proteína disuelta en una disolución tamponada a un pH determinado, se coloca en un campo eléctrico. En función de la relación entre el pH del buffer y el pI de la proteína. Enfoque isoeléctrico: Se utilizan mezclas de anfolitos formados por ácidos poliamino-policarboxílicos con un intervalo definido de valores de pI para establecer un gradiente de pH a través de un campo eléctrico aplicado, aquí la proteína cargada se desplaza a través del gradiente de pH hasta alcanzar una región donde el pH=pI, en este punto la proteína se mantiene estacionaria y se puede visualizar. Cromatografía en columna de intercambio iónico: Se utiliza para la separación preparativa de proteínas basadas en su carga.
Las resinas son materiales insolubles que contiene grupos cargados, hay dos tipos de resinas:
Resinas de intercambio catiónico
Resinas de intercambio aniónico. El grado de retardo depende de la magnitud de la carga de la proteína al pH del experimento. Electroforesis capilar (A)
se llena un tubo capilar de silice con medio de electroforesis
se inyecta una banda de muestra en el extremo del tubo (ánodo) (B)
Al aplicar un campo eléctrico una capa de cationes se desplaza hacia el ánodo
las moléculas con analito fluyen hacia el cátodo con mayor velocidad
las moléculas aniónicas son repelidas por éste Se realiza en parecencia de un único tampón Anfolitos: separacion por enfoque isoelectrico
Gel poroso: separacion por masa molecular
Compuesto micelar: separacion por hidrofobiedad Separación de proteínas basada en la masa molecular o en el tamaño Ultracentrifugación: Definición del coeficiente de Svedberg Una proteína sometida a una fuerza centrífuga se desplaza en la dirección de la fuerza a una velocidad que depende de su masa.

La velocidad se mide con un sistema óptico adecuado, y a partir de ella se calcula el coeficiente de sedimentación.

Ecuación para el cálculo del coeficiente de Svedberg Ecuación que relaciona el coeficiente de Svedberg con la masa molecular: La ecuación presupone que la proteína tiene una geometría esférica.
El coeficiente de sedimentación de una proteína es una medida cualitativa de su masa molecular. Cromatografía de exclusión molecular Para separa proteínas según su tamaño mediante cromatografía en columna se utiliza frecuentemente un gel poroso en forma de pequeñas esferas insolubles.

Al igual que con la ultracentrifugación se presume una geometría determinada de la proteína en la determinación de la masa molecular.

Las proteínas alargadas dan masas moleculares anómalas cuando se analizan con una gráfica estándar confeccionada con proteínas de geometría esférica. Electroforesis sobre gel de poliacrilamida en presencia de un detergente. La separación de las proteínas se basa en el tamaño y no en la carga.

Detergente mas usado:
Dodecil sulfato sódico (SDS).- Son alquil sulfatos anfifílicos de 12 C’s.
Función:
Estabilizar la proteína desnaturalizada. Soporte tamizante:

Poliacrilamida entrecruzada.

Las partículas cargadas negativamente se mueven a través de esta hacia el ánodo.

La poliacrilamida actúa como un tamiz molecular, y los complejos proteína-micela se separan en función de su tamaño. Técnicas cromatografías de HPLC Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Un disolvente líquido con la mezcla de moléculas a identificar, se hace pasar a través de un columna densamente empaquetada con pequeñas esferas de resina insoluble.
El liquido se pasa por la columna a elevada presión.
Las resinas pueden recubrirse con grupos químicos que puedan separar por intercambio iónico o por grupos hidrofóbicos. Cromatografía de afinidad: Las proteínas tienen gran afinidad por sus sustratos.
Los compuestos con gran afinidad pueden unirse de forma covalente a la resina insoluble.
La resina modificada puede utilizarse para purificar la proteína conjugada mediante la cromatografía en columna. integrantes: Acosta López Mariana
Meza Martínes Thalía Estefanía
López Castillo Lilia Ivone
Ornelas López Lesly
Salazar Morín Karla Azucena
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