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Teórica qPCR en Microbiología Ambiental

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by

Hebe Dionisi

on 12 January 2015

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Transcript of Teórica qPCR en Microbiología Ambiental

La qPCR en Microbiología Ambiental
Principios básicos de la qPCR
Diseño, optimización y validación de ensayos
Análisis de muestras ambientales
RT-qPCR
PCR
Claridad conceptual, accesibilidad y fácil aplicabilidad tecnología más importante de la biología molecular
Inventada en 1983 por Kary Mullis (Premio Nobel de Química 1993)
Los productos de amplificación son analizados en geles de agarosa
Baja sensibilidad, pobre precisión
Rango dinámico limitado < 2 logs
Baja resolución
Difícil de automatizar
Discriminación sólo basada en tamaño
Resultados no expresados numéricamente
Tinción no cuantitativa
PROBLEMAS DE LOS GELES DE AGAROSA
Dra. Hebe Dionisi
Laboratorio de Microbiología Ambiental
Centro Nacional Patagónico (CENPAT-CONICET)

1991
: Metodología TaqMan
NACIMIENTO DE LA qPCR
1993
: Acumulación cuantitativa de fluorescencia de EtBr
1995
: Sondas de hibridización
1996
: primer instrumento, primeras publicaciones
LA qPCR ES UTILIZADA DE RUTINA EN INVESTIGACIÓN, CLÍNICA, FORENSE, ETC.
EQUIPOS DE PCR EN TIEMPO REAL
Detecta productos al final de la reacción de amplificación
Requiere de manipulación post-PCR para visualizar el producto (contaminación)
Analiza múltiples productos sólo con diferentes tamaños
No es cuantitativa
PROBLEMAS DE LA PCR
Genome Research
20,000 USD - 150,000 USD
Puede contener:
Gradiente de temperatura
Diferentes formatos (48, 96, 384, 1536-well)
Diferentes sistemas térmicos (bloque, aire, etc)
Diferentes uniformidades y precisiones de T
Diferentes velocidades de rampa
Capacidades para 1 o múltiples detecciones
Diferentes fuentes de luz para la excitación (filtros, laser, light-emitting diodes (LEDs)
Diferentes sistemas de detección de la luz emitida [photo-multiplier tubes (PMTs), photodiodes, charge-coupled device (CCD) cameras]
Ciclador

Sistema óptico que emite luz con detección de la fluorescencia generada

Software para controlar la operación del instrumento y colectar los datos generados
3 PARTES
VENTAJAS DE LA qPCR
Amplificación monitoreada en tiempo real
Sin procesamiento post-PCR (evita contaminaciones)
Programa rápido (30 minutos a 2 horas)
Mayor especificidad, sensibilidad y reproducibilidad
Confirmación de la especificidad de la amplificación (curvas de desnaturalización)
Amplio rango dinámico 10 - 10
Alta capacidad de procesamiento de muestras
8
9
DESVENTAJAS DE LA qPCR
Requiere de un equipo de PCR en tiempo real
Alto costo del equipo y sus insumos
Requiere de personal altamente entrenado
Dificultad para analizar múltiples templados
Dificultad para disminuir la variabilidad en los ensayos
CURVA TÍPICA DE AMPLIFICACIÓN
Se determina la fluorescencia en cada ciclo del programa de amplificación
CURVA ESTÁNDAR
MÁS ADN
MENOS ADN
REPRESENTACIÓN EN ESCALA LINEAL VS. LOGARÍTMICA
Se calcula el ciclo en donde la curva de amplificación coincide con el valor umbral (Cq o ciclo de cuantificación)
Se fija un valor umbral por encima de la fluorescencia basal (threshold) dentro de la fase exponencial
Los valores de Cq (o Ct) de amplificaciones con valores conocidos de templado son usados para calcular una curva estándar
CONSIDERACIONES IMPORTANTES
El buen diseño y optimización del ensayo es crítico para obtener datos de calidad
Los valores de abundancia obtenidos son relativos a un estándar, y son estimaciones
La precisión del ensayo debe ser evaluada
El rango de linealidad del ensayo debe ser evaluado
El impacto de la muestra ambiental debe ser considerado
El éxito depende de un profundo conocimiento de los principios de la tecnología
ANÁLISIS DE MUESTRAS
CÁLCULO DE LA EFICIENCIA DE AMPLIFICACIÓN
MÉTODOS DE DETECCIÓN CUANTITATIVA
COLORANTES DE UNIÓN A ADN DOBLE HEBRA
VENTAJAS
Emite fluorescencia fuerte
Permite amplicones largos, con señal fuerte
Puede usarse cualquier par de cebadores
Simple de implementar, más económico
Permite el uso de curvas de desnaturalización

DESVENTAJAS
Afectado por dímeros de primers y amplificaciones inespecíficas
Requiere extensa optimización
Requiere del uso de curvas de desnaturalización
No es adecuado para reacciones paralelas
SYBR Green I
SONDAS DE HIDRÓLISIS
La hidrólisis de la sonda durante la amplificación separa el fluoróforo del quencher, incrementándose la fluorescencia
Se usan sondas fluorescentes con fluoróforo 5' y quencher en 3'
FRET: FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER
VENTAJAS
La hibridización de la sonda aumenta la especificidad
Se pueden usar distintos colorantes fluorescentes, para detectar distintos genes blanco (multiplexing)

DESVENTAJAS
Las sondas son costosas
El ensayo debe ser diseñado específicamente
Pueden ser excesivamente específicos: subestiman la abundancia del gen blanco
EFICIENCIA DE LA qPCR:

La eficiencia de la qPCR es del 100% cuando el amplicón duplica cada ciclo

Idealmente debería ser 90-110%

3,3 ciclos cada dilución 1:10 del templado
Eficiencia de hibridización del cebador

Eficiencia de unión de la polimerasa

Eficiencia de elongación
3 TIPOS DE EFICIENCIA:
EXTRACCIÓN DE ADN METAGENÓMICO
CONTROL DE LA INHIBICIÓN DE LA qPCR
% DE RECUPERACIÓN DEL ADN
¿CÓMO EXPRESAREMOS LOS DATOS?
¿QUÉ TIPO DE ENSAYO?




¿QUÉ TIPO DE MIX?
EVITANDO ERRORES TÉCNICOS
Mezclar bien los reactivos antes de pipetear
Alicuotar los reactivos
CÓMO MINIMIZAR LA VARIABILIDAD
EVITANDO CONTAMINACIONES
Usar pipetas adecuadas y calibradas
Orden del pipeteo
Organización del laboratorio
Extracción de ADN
Pre PCR
qPCR
Pipetas
Pipetas
Descontaminación previa
UV
10% lavandina
DNA away
workstation
Guantes
Puertas, freezers
Agua, mix, primers
Freezer
tips filtro
Por último la muestra
PRINCIPALES PROBLEMAS
Inconsistencia en la lisis celular
Inhibición de la amplificación
Bajo rendimiento
Bajo peso molecular
¿SI TENGO INHIBICIÓN QUÉ HAGO?
PRINCIPALES FUENTES DE VARIABILIDAD
Diluimos el ADN
Cambiamos el método de extracción de ADN
Agregamos un paso de purificación
CONSERVACIÓN DEL ADN
MÉTODO DE EXTRACCIÓN
CONTROL DE CALIDAD
ADN EXTRACELULAR
CONCENTRACIÓN DE ADN
2 ORDENES DE MAGNITUD DE DIFERENCIA

Tubos low binding
Ultrafreezer
Alícuotas
ADN concentrado
¿Nuestro ADN purificado contiene inhibidores de la amplficación?
Kit vs. método manual
¿Qué método de lisis usa?
¿Seguimos exactamente las instrucciones del fabricante?
¿Cuál es el rendimiento obtenido?
¿Qué peso molecular tiene nuestro ADN?
¿Cuál es su límite de detección?
¿Qué métodos de medición de la concentración de ADN tengo disponibles?
¿Qué estándar uso?
¿Qué compuestos pueden interferir mi medición?
¿Cuántas réplicas debo hacer?
¿ES EL ADN REPRESENTATIVO?
No todo el ADN presente en la muestra es recuperado en la extracción
En algunos microorganismos el ADN será más fácil de recuperar que en otros
El % de recuperación puede variar de muestra a muestra
Diseño de muestreo
Muestras compuestas
Réplicas
Múltiples extracciones de ADN por muestra
Pool
Análisis independientes
Tamaño adecuado de la muestra
Si no se controla la existencia de inhibición, estaremos subestimando la abundancia del gen en estudio
Compuestos que copurifican con el ADN pueden afectar la amplificación
Cuantificamos el gen a distintas concentraciones de ADN
Agregamos estándar a la muestra ambiental (spiking)
Copias del gen/microgramo de ADN

Copias del gen x relativo a las copias del gen y

Copias del gen/g o ml de la matriz ambiental
% de recuperación de ADN
Tiempo de optimización
Dinero disponible
Número de muestras a analizar
Diversidad del gen
Mix casera
Supermix comercial
APLICACIONES EN MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
Dinámica de una población o gremio

Abundancia relativa dentro de una comunidad: relevancia ecológica

Respuesta ante cambios en las condiciones ambientales
Distribución de la población en estudio en el ambiente
LIMITACIONES Y DESAFÍOS
Método útil para diferencias de abundancia de medio orden de magnitud o superior

Alta variabilidad, difícil de controlar

Amplificaciones inespecíficas

Inhibición de la amplificación

Sobreestimación o subestimación de la abundancia del gen blanco
1- Variabilidad biológica
2- Variabilidad técnica
3- Diseño experimental inapropiado
Heterogeneidad espacial y temporal
Variaciones en copias/célula
Variaciones estocásticas
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Inconsistencias introducidas en las distintas etapas del protocolo
ATENCIÓN METICULOSA A LOS DETALLES DEL DISEÑO EXPERIMENTAL, EJECUCIÓN E INTERPRETACIÓN DEL ENSAYO
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS
DATOS PRECISOS Y CONFIABLES
CONTROLES, ESTÁNDARES, RÉPLICAS
DISEÑO, OPTIMIZACIÓN, VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS
EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL ADN
OBTENCIÓN, TRANSPORTE, ALMACENAMIENTO
DE LAS MUESTRAS
Procedimientos inadecuados, uso inconsistente o incorrecto de controles, análisis de datos y métodos estadísticos
DISEÑO DE ENSAYOS DE qPCR
DISEÑO DE CEBADORES/SONDAS
PASOS DE LA OPTIMIZACIÓN DE ENSAYOS DE qPCR
IMPORTANCIA DE LA OPTIMIZACIÓN DE LOS ENSAYOS
OPTIMIZACIÓN DE LA TEMPERATURA DE ALINEADO DE LOS CEBADORES
ELIMINANDO LA INTERFERENCIA DE LOS DÍMEROS DE CEBADORES
DISEÑO DE CEBADORES
VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS DE qPCR: ESPECIFICIDAD
SECUENCIACIÓN
CONSIDERACIONES PARA EL DISEÑO DE ENSAYOS DE qPCR
VALIDACIÓN DE LA COBERTURA DEL ENSAYO
Geles de agarosa
Curvas de desnaturalización
Secuenciación del amplicón
¿QUÉ ES LA RT-qPCR?
MUESTREO Y PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
EXTRACCIÓN DE ARN
CALIDAD DEL ARN
APLICACIONES
CONSIDERACIONES FINALES
¿Es el tamaño del amplicón el esperado?
¿Coinciden los picos en el estándar y en la muestra?
¿Es la secuencia la esperada?
Difícil de determinar
Análisis usando BLAST al momento del diseño del ensayo
Análisis usando BLAST al momento de la publicación
¿QUÉ BUSCO?
¿Qué porcentaje de las secuencias de la base de datos blanco de mi ensayo presentan 100% identidad con mis cebadores/sonda?
¿Dónde se ubican las bases no apareadas?
¿Alguna secuencia no blanco de mi estudio tiene 100% de homología con mis cebadores/sonda?
¿Sería posible encontrarla en mi muestra?
Secuencias que no están presentes en la base de datos pueden estar en mi muestra
Involucra el diseño de los cebadores/sondas para la detección de los genes de interés
El diseño de cebadores/sonda para amplificar una familia de genes es complejo
Idealmente debería cubrir a miembros conocidos y desconocidos de una familia de genes
A menudo es necesario incluir degeneraciones
Distintos tripletes traducen en el mismo aminoácidos
Distintas secuencias de aminoácidos pueden tener la misma función
Riesgo de subestimar la diversidad y abundancia de esta familia de genes
Falta de cobertura de las bases de datos
DISEÑO MANUAL
DISEÑO UTILIZANDO SOFTWARE
Amplificar las distintas variantes del gen a similares eficiencias
Unirse a regiones conservadas de todas las variantes de la secuencia blanco
NECESIDADES
La eficiencia de amplificación variará dependiendo de cuánto se parezca a la secuencia blanco


100% identidad: alineado y amplificación más eficiente, con respecto a la presencia de bases no apareadas


Dependiendo de la posición de la base no apareada, algunas variantes del gen pueden no ser detectadas en el ensayo
CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)
http://blocks.fhcrc.org/codehop.html
Genefisher
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher
HYDEN (HighlY DEgeNerate primers)
http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/HYDEN.htm
PriFi
http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main
DEGENERACIONES DE LOS CEBADORES
Algunas de sus posiciones presenta varias bases posibles

Se sintetizan como una mezcla equimolar de un número de cebadores

La degeneración del cebador es el número de combinaciones de secuencias que contiene

Sólo una fracción de estos oligos serán capaces de hibridizar

Es necesario incrementar la concentración el cebador en la rxn
2 x 2 x 2 x 2 = 16
Inosina puede aparear con cualquier nucleótido
A
adenina
R
A o G
C
citosina
W
A o T
G
guanina
S
C o G
T
timina
Y
C o T
N
A o C o G o T


K
G o T

M
A o C


H
A o C o T

V
A o C o G


B
C o G o T
D
A o G o T
18 - 30 nucleótidos, distancia aprox. 100 bp
40 - 60% GC or similar al contenido del templado
Tm 55 - 65ºC similares entre sí
Evitar bases no apareadas con el blanco
Evitar demasiadas degeneraciones (extremo 3’)
Evitar polyX
Evitar secuencias complementarias (dímeros de cebadores)
Evitar estructuras secundarias
Evitar extremo 3’ rico en GC (2 en los últimos 5 nt)
Usar GC clamp (maxima estabilidad)
CÓDIGO IUPAC
CEBADORES
SONDAS TAQMAN
Debe ser diseñado primero
Contenido GC 30-80 %
Evitar polyX
Evitar G en el extreme 5’
Seleccionar la hebra con más Cs que Gs (sonda)
Tm 68-70ºC (10ºC más que los cebadores)
Lo más cercano al primer posible (5-10 bases)
Agregar colorante fluorescente en 5’ y quencher en 3’
COLORANTES FLUORESCENTES/QUENCHERS
SÍNTESIS DE LOS OLIGOS/SONDAS
Espectro genérico de excitación y emisión de un colorante fluorescente
QUENCHERS BH
SF: remueve químicos de la síntesis y desprotección
Oligos > 70 bases usar purificación en dos etapas
HPSF: cromatografía de fase reversa (cartridge)
SYBRGREEN I vs. EVAGREEN
Más seguro

Mayor fluorescencia

Alta resolución en curvas de desnaturalización

Sirve para qPCR, cuantificación de ADN y tinción de geles

Estable
Importancia de la caracterización previa del sitio antes del diseño de los ensayos de qPCR
Esto es debido a la distribución biogeográfica de las poblaciones microbianas
Estudios realizados en otros sitios pueden no representar a las poblaciones del lugar
La optimización del ensayo de qPCR debe ser exhaustiva

Deben encontrarse las mejores condiciones para cada una de sus variables

Aumenta su reproducibilidad, robustez, sensibilidad y especificidad
Marca o componentes de la mix


Temperatura de alineado de los primers


Concentración de cebadores/sonda


Validar desempeño con curva estándar (sensibilidad y rango dinámico)


Concentración de ADN metagenómico
Gradiente 2-3ºC
Estándar y muestra
Evaluar especificidad en la muestra
Ct el más bajo posible
Fluorescencia relativa la más alta posible
Amplificación específica
Forward
300 600 900 nM
300 x x x
600 x x x
900 x x x
Reverse
– Especificidad

– Alta eficiencia de la reacción

– Alta reproducibilidad

– Alta sensibilidad

– Amplio rango dinámico
CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN ENSAYO DE qPCR
Se observa un pico extra a la izquierda en las curvas de desnaturalización
OPCIONES:

Rediseñar los cebadores

Incorporar una temperatura de lectura en el programa
Secuenciación directa del producto de PCR
Clonado (TOPO TA cloning kit for sequencing)
RT-qPCR permite medir expresión génica

Es un ensayo de qPCR donde se agrega un paso de síntesis de cDNA

Alta sensibilidad

Método alternativo: transcriptómica o metatranscriptómica

Más costoso pero superior en la información aportada
Analizar la variabilidad
MUESTRA
ARN
cDNA
qPCR
Datos
La RT-qPCR puede ser realizada en 1 o en 2 etapas
EXTRAER ARN (Y PRESERVARLO) ES MÁS DIFICULTOSO CON RESPECTO AL ADN

LA VIDA MEDIA DEL ARN ES MUY BAJA

LA VARIABILIDAD DE LA EXPRESIÓN EN CÉLULAS INDIVIDUALES ES MUY ALTA

EL PASO DE SÍNTESIS DE cDNA ES CRÍTICO PARA LA RT-qPCR
El rendimiento es bajo (10-20% del ADN)

Sólo 1-5% es mRNA

Es necesario usar más muestra
Copurificación de inhibidores es un problema
(ácidos húmicos y fúlvicos, policacáridos y polifenoles)
RNALater

RNA Protect

LifeGuard™ Soil Preservation Solution (MOBio)
SOLUCIONES ESTABILIZADORAS:
El ARN es muy inestable

Congelación inmediata en nitrógeno líquido en el sitio de muestreo

El muestreo se vuelve dificultoso en áreas remotas

Alternativa: uso de soluciones estabilizadoras

Mantienen la integridad de los ácidos nucleicos y son bacteriostáticas
Se requiere alta concentración de ARN para la RT
Al igual que con el ADN, la calidad del ARN debe ser evaluada

Libre de proteínas (260/280 1,8 - 2,0)

No degradado, libre de nucleasas

Libre de sustancias inhibidoras

Libre de ADN genómico
Fácilmente degradable
AL TRABAJAR CON ARN
Siempre usar guantes
Pipetas sólo para ARN
Tips con filtro
Material libre de RNAsas
Trabajar en esterilidad
Utilizar agua tratada con DEPC
Tratar mesadas, pipetas, cubas con RNase Erase
Cada uno tiene ventajas y desventajas
RT-qPCR EN UNA ETAPA
RT-qPCR EN DOS ETAPAS
VENTAJAS
DESVENTAJAS
La RT y la qPCR ocurren en el mismo tubo
Mínimo manipuleo, menos riesgo de contaminación
Facilita el procesamiento de un gran número de muestras
Útil al trabajar con pocos genes
Único buffer optimizado para ambas reacciones
Dificultad para ajustar la concentración de templado
Dímeros de cebadores durante la RT a baja temperatura
Menos sensible
VENTAJAS
DESVENTAJAS
La RT y la qPCR ocurren en dos tubos
Puedo usar el cDNA en más de una reacción de qPCR
Mayor facilidad para regular la concentración de templado
Más sensible, flexible y eficiente
Útil al trabajar con muchos genes
Mayor manipuleo
Mayor riesgo de contaminación
Los equipos de PCR en tiempo real son accesibles y presentan múltiples aplicaciones
Con las consideraciones necesarias, presentan el potencial de generar información de gran utilidad sobre las comunidades microbianas
Abundancia de determinadas poblaciones o gremios dentro de una comunidad
Cambios producidos en el tiempo y en el espacio, o experimentos en condiciones controladas
qPCR
¿Cuál es la abundancia de un determinado gen funcional dentro de una comunidad?
(POTENCIAL METABÓLICO)
LOS DATOS SE EXPRESAN
Cuantificación absoluta: con respecto a una curva de calibración externa
RT-qPCR
¿Este gen está siendo expresado?
(POTENCIAL METABÓLICO)
(ACTIVIDAD METABÓLICA)
MARCADOR FILOGENÉTICO
MARCADOR FUNCIONAL
¿Cuál es la abundancia de un determinado grupo taxonómico dentro de una comunidad?
(PERFIL TAXONÓMICO)
¿Qué tan metabólicamente activo es este grupo taxonómico dentro de la comunidad?
(POTENCIAL METABÓLICO)
¿Los niveles de expresión génica se corresponden con el nivel de proteínas?
Células metabólicamente activas
Cuantificación relativa
A una muestra control
Al T0
A otro gen
A un gen de referencia (expresión cte)
A un grupo de genes de referencia (índice)
A la expresión media del gen blanco
CONSIDERACIONES IMPORTANTES
Protocolo de muestreo diseñado para minimizar la variabilidad
Número apropiado de réplicas biológicas y técnicas (menor a 0,3 Cq)
Método de extracción que produzca ARN total de alta calidad
Digerir con DNAsa I
RT robusta
Evaluar rendimiento y calidad del cDNA
Cuidado en el diseño de ensayos
Uso de controles apropiados
Minimización de errores técnicos
Todas las muestras en la misma corrida
Diferencias en Cq mayores a 0,5
498 nm
522 nm
Colorante fluorescente
Colorante fluorescente**
Absorción de luz
Colorante fluorescente
Colorante fluorescente**
Emisión de luz
SIN QUENCHER
Colorante fluorescente**
+ Quencher
Transferencia de energía
CON QUENCHER
Colorante fluorescente
+

Quencher**
Quencher
Quencher**
Decaimiento no radioactivo
AFECTAN LA EFICIENCIA

Longitud del fragmento
Estructura secundaria
Incorrecto diseño de los cebadores
Pobre calidad de los cebadores
Presencia de inhibidores de la PCR
Errores de pipeteo de reactivos y muestras
Incorrecto análisis de los datos
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