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YEISON

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Nataly Hernández

on 30 October 2012

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Transcript of YEISON

DESCRIPCIÓN DE LAS RDT PARA EL DIAGNÓSTICO DE MALARIAY EL PROBLEMA CON LA DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA PfHRPII UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ
2012 Presentado por: Yeison Steven Rojas Siachoque MALARIA
La malaria es una enfermedad que se adquiere a partir de la picadura del mosquito hembra del genero Anofeles, el cual al picar al ser humano transmite el parasito Plasmodium, Hay cinco especies del genero Plasmodium que tienen la capacidad de infectar a los seres humanos, las cuales son:
P. vivax
P. ovale
P. malariae
P. knowles.
P. falciparum.
Actualmente la enfermedad es considerada como un problema de salud pública mundial ya que anualmente cobra la vida de un gran número de personas alrededor del mundo. MALARIA El numero aproximado de muertes por la enfermedad es de 655.000 Situación de malaria en el mundo Two (cc) photo by medhead on Flickr Para el año 2010 se presentaron aproximadamente 216 millones de casos de malaria en todo el mundo. El 91% de todos los casos reportados fueron causados
por la especie
P.falciparum. Fueron notificados para el año 2011 un total de 62.716 casos, con la presencia de 18 casos fatales.

A continuación se presenta la proporción de casos de malaria según la especie infectante:

P. vivax 73.7%
P. falciparum 25 %
P. malariae 0.04%
infecciones mixtas 1.3%. Casos reportados de malaria en Colombia Los departamentos de Colombia que reportaron para este año el mayor numero de casos fueron:
Antioquia 25.271
Choco 11.490
Córdoba 9.545
Nariño 3.511 Es la técnica Gold standard para el diagnostico de malaria, se basa en la concentración de parásitos debido al aglomeramiento de los glóbulos rojos, facilitando de esta manera la detección de parasitemias bajas, las ventajas que posee esta técnica son :

Economia.
Detección de parasitemias bajas.
Permite realizar un diagnostico diferencial de especie.
Reporte del nivel de parasitemia.

Los limites de deteccion de esta prueba es de 40 parásitos por microlitro de sangre. Gota gruesa La PCR impleada en el diagnóstico molecular de malaria es una PCR anidada la cual consta de dos fases:

Primera fase: se realiza una PCR utilizando primers específicos para la detección del genero Plasmodium, los cuales amplifican la subunidad 18s del rRNA.

Segunda fase: se utiliza el producto de la primera amplificación de PCR como plantilla para ser amplificado con primers específicos de especie.
 
Las ventajas de esta técnica radican en su alto nivel de sensibilidad, con un límite de detección de 5 parásitos por microlitro de sangre y es ideal para revelar la presencia de infecciones mixtas. DIAGNOSTICO DE MALARIA Pruebas de diagnóstico rápido “RDT" Generar un diagnostico en un tiempo aproximado de 20 minutos.
Las pruebas son sencillas de utilizar.
Se puede suministrar el tratamiento inmediatamente el paciente sea diagnosticado.
Permiten la identificación de la especie causal de la enfermedad. Ventajas del Diagnostico Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales de tipo Ig G e Ig M, las cuales pueden ir dirigidas a tres diferentes tipos de antígenos los cuales son:
La proteína dos rica en histidina de P. falciparum (PfHRPII).
La enzima lactato deshidrogenasa (pLDH). La enzima Aldolasa. Las RDTs más utilizadas en el mercado han reportado una sensibilidad del 97% en parasitemías mayores a 100 parásitos/uL Niveles de sensibilidad Factores relacionados con la prueba
Defectos de fabricación.
Deterioro del dispositivo.
Fallas técnicas en la realización de la prueba.
Mala interpretación de los resultados.
Daño de la membrana de nitrocelulosa al exponerla a altas temperaturas.
Factores relacionados con el parásito
Nivel de parasitemia (menores a 100 parasitos /uL o mayores a 100.000 parásitos /uL).
Polimorfismo de los epítopes.
La ausencia en la expresión del antígeno.
Fundamentadas en la detección de tres antígenos específicos:

Proteína dos rica en histidina de P. falciparum (PfHRPII).
enzima lactato deshidrogenasa (pLDH).
Aldolasa Especifica para el diagnóstico de P. falciparum.

La proteína se produce durante todo el ciclo asexual intraeritrocitario y en las primeras etapas de desarrollo de los gametocitos.

Estrcuturalmente posee un gran contenido de los aminoácidos:
Histidina (34%).
Alanina (37%) .
Acido aspártico (10%).

Hasta el momento no se tiene clara la función de la proteína PfHRPII, sin embargo, se sugiere que esta proteína puede promover la desintoxicación de la ferriprotoporfirina IX. Una causa es el alto polimorfismo que presenta esta proteína, lo cual influye en el reconocimiento del antígeno por parte de los anticuerpos empleados en las RDT.

Otra causa es la deleción del gen que codifica para esta proteína, lo cual no se encontraria en antigeno a reconocer por la tecncia.
  Problemas con la detección de la proteína PfHRPII RESULTADOS Proteína dos Rica en Histidina de P. falciparum (PfHRPII). Evaluación de las RDTs en Colombia. La aplicación de las RDT en diferentes lugares del mundo ha permitido mostrar una gran variación en los niveles de sensibilidad y especificidad, lo cual conlleva a analizar que estos niveles varían dependiendo:

La Marca de las RDT.
El tipo de antígeno que reconozca la prueba.
Sin embargo otros factores que pueden disminuir estos valores, uno de los más importantes es el nivel de parasitemia.
Es de anotar que los casos en donde el diagnóstico por gota gruesa es negativo y por RDT positivo, se debe a la capacidad de la proteína PfHRPII de durar hasta treinta días en circulación.

Al evaluar el diagnóstico mediante PCR se encontró una sensibilidad y especificidad del 100% como es de esperarse, debido a que esta técnica es mucho más sensible que la gota gruesa. DISCUSIÓN SOBRE LAS RDT El análisis sobre la mejor RDT para la detección de la enfermedad ha logrado demostrar que:

las RDTs basadas en la detección del antígeno PfHRPII presentan muchas diferencias en sensibilidad y especificidad entre un estudio y otro.
Los diagnósticos realizados por RDTs basadas en la detección de la enzima pLDH, son técnicas con buena sensibilidad y especificidad. La proteína PfHRPII es muy variable tanto en la secuencia de aminoácidos como en el tamaño de la proteína, entre diferentes muestras.

Relacionando los estudios sobre el polimorfismo de la proteína, se puede determinar que del 100% de todas las muestras procesadas, el 76.6% presentaban una secuencia única del la proteína PfHRPII.

Una explicación del porque esta proteína es muy polimórfica, se encuentra en la ubicación del gen que codifica para esta proteina.

La ubicación de este gen es en la región sub telomerica; los genes que se encuentran en estas regiones son muy variables y de rápida evolución.
Los mecanismos por los cuales se puede presentar esta variabilidad genética en Plasmodium son la mutación, el entrecruzamiento genético y la selección Natural. Los hallazgos encontrados sobre las muestras que presentan la ausencia del gen pfhrp2 y el gen pfhrp3; implica que estos genes no son necesarios para la supervivencia del parasito.

Una de las maneras por las cuales el gen este ausente son los procesos de rompimiento y reparación de los cromosomas en las regiones subteloméricas, donde se encuentra ubicado el gen que codifica para la proteína PfHRPII. La utilización de las RDT en zonas de difícil acceso puede ser una buena alternativa para el diagnóstico de malaria, debido a todas las características y ventajas que poseen, sin embargo, hay que tener en cuenta los problemas de sensibilidad y los limites de detección que presenta esta técnica. Ademas se debe tener en cuenta para la utilización de una RDT, el tipo o tipos de antígeno que reconoce, el nivel de detección de la técnica, la marca de la prueba.
 
La importancia de los estudios de la proteína PfHRPII sobre los altos índices de polimorfismo que presenta y la muestras de campo que no presentaban el gen que codifica para esta proteína, fue establecer la posibilidad de presentar falsos negativos en la utilización de las RDT que se fundamenten en la detección de este antígeno. CONCLUSIONES
Se recomienda realizar estudios experimentales y de campo que busquen identificar si las cepas de P.falciparum que circulan en el territorio Colombiano presentan o no el polimorfismo de la proteína PfHRPII.

Se recomienda utilizar técnicas de diagnostico rápido que no se basen en la detección de la proteína PfHRPII, ya que se podría presentar falsos negativos.
  RECOMENDACIONES Casos reportados de malaria
en el mundo PCR Fundamento de las tecnicas de las RDTs
Figura Nº 2 Ilustración de una RDT basada en la detección de la enzima pLDH. El fundamento de estas pruebas es la inmunocromatografia Infraestructura de las RDT Figura 3 Esquema de las RDT. W= Área para la muestra
A= Almohadilla que contiene el anticuerpo conjugado con oro coloidal
T= Línea de prueba donde se encuentra el segundo set de anticuerpos específico.
n = Membrana de nitrocelulosa.
C= Línea de control, donde se encuentra el antianticuerpo.
S= Almohadilla que absorbe la muestra sin reaccionar después de concluir la prueba.
P = Soporte de plástico. factores que afectan sus niveles de sensibilidad y especificidad Generalidades
Tabla No. 1 Niveles de sensibilidad y especificidad de
las RDT, encontrados en diferentes estudios. Tabla No 2: Valores de sensibilidad y especificidad obtenidas por las técnicas comerciales NOW® ICT y OptiMAL® en el diagnóstico de malaria. Tabla No. 3 Valores de sensibilidad y especificidad obtenidas por las técnicas comerciales Paracheck-Pf, Optimal, NOW Malaria ICT. Tabla No. 4 Valores de sensibilidad y especificidad de la PCR y la técnica OptiMAL® Tabla No. 5 Repeticiones de aminoácidos de la proteína PfHRPII
Tabla No 6 Polimorfismo de la proteína PfHRPII.
Tabla No 7 Muestras que presentan la presencia o ausencia del gen pfhrp2. Discusión sobre las RDT Discusión sobre la proteína PfHRPII Discusión sobre la proteína PfHRPII Discusión sobre la proteína PfHRPII
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