Loading presentation...
Prezi is an interactive zooming presentation

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL

No description
by

Katherine campos layza

on 6 May 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL

MÉTODOS DE
DIAGNÓSTICO VIRAL

El diagnóstico viral comprende la detección e identificación del agente etiológico de una infección viral, clínica o inapetente, y/o de la respuesta inmune específica del huésped.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL
DIRECTO
Va a demostrar la
presencia del virus
o algunos de sus constituyentes (
antígeno o genoma viral
)
INDIRECTO
Va a demostrar
la respuesta de anticuerpos
específicos por parte de huésped en el curso de la infección.
MÉTODO DIRECTO
Van a detectar:
El virus como agente infeccioso
La presencia de antígenos virales
La presencia de ácidos nucleicos virales
El virus como particula viral
AISLAMIENTO VIRAL
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
Determinan antígenos
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR
Determina la presencia de ácidos nucleicos virales.
Esta técnica esta desarrollada a partir de estudios de la Biología Celular.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas.
VENTAJAS
Tiene una especificidad y sensibilidad muy alta.
DESVENTAJAS
El proceso suele ser lento
Requiere de sistemas de cultivos adecuados
Va a detectar el virus como agente infeccioso
CULTIVOS CELULARES
Son los biosustratos más corrientemente empleados para la propagación del virus.
Las células se obtienen de explantes de órganos o embriones de animales.
Las células obtenidas se disocian por medio de una enzima que va a romper el cemento celular.
La suspención de las células libres se adhiren a la superficie del recipiente en donde va a empezar a multiplicarse formando monocapa celular.
La monocapa celular va a empezar a crecer en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosas, etc.
Existen 3 tipos de cultivos celulares: cultivos primarios, líneas celulares diploides y líneas celulares diploides.
DIAGNÓSTICO VIRAL
Se inocula el cultivo celular
Se incuba a 35 - 37 °C por apróximadamente 14 días
Se espera la aparición del efecto citopático
Se observa el cultivo en el microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana
Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)
Recolección de muestras apropiadas
Se colocan sobre un portaobjetos donde se va a dejar secar y enfriar
Se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína
Se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células
La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Se utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra.
Se puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares.
Resulta útil para la identificación rápida de ciertos virus como los virus respiratorios.
Esta técnica requiere sólo 2-4hs.
Puede estudiar varias muestras simultáneamente.
La realización de la reacción es laboriosa.
Depende mucho de la calidad de los reactivos.
Requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero.
TEST DE AGLUTINACIÓN
A veces se usa para la detección de antígenos virales en muestras clínicas.
Se fijan anticuerpos irales específicos sobre eritrocitos o partículas de latex
Se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno.
Las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Es un método simple, de un solo paso
Es una técnica rápida y barata.
Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeñas y mezcladas con muchas otras.
DIAGNÓSTICO
1
Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y anticuerpo para ese antígeno
2
Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
3
Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece libre
4
Se determina la radioactividad
5
Si la muestra contiene además antígeno frío (no marcado), éste competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observará un descenso en la medida de la radioactividad
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Tienen una buena sensibilidad y especificidad.
Menor tiempo de conservación de los reactivos.
Presencia de reciduos radioactivos.
ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA)
Se basa en la captura del antígeno por anticuerpos específicos a una base sólida.
DIAGNÓSTICO
1
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
2
El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida
3
El antígeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima.
4
La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas es un peróxido.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada.
No requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados.

SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Determina la presencia de ácidos nucleicos virales.
1
Se extrae secuencias específicas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restricción.
2
Luego estas secuencias extraídas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un isótopo radioactivo.
3
A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos.
SONDAS SINTÉTICAS
Determina ácidos nucleicos virales
Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos.
Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del DNA del virus
Se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación.
La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.
Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación:
Si está marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma.
Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Nos permite ver al virus como partícula viral
El costo del microscopio
Necesita de una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra
Es poco sensible.
MÉTODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped.
Detección de anticuerpos específicos antivirales.
Producción de anticuerpos in vitro.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA)
La metodología es la siguiente: Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetas para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en algunos casos de forma visual.
PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO
Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extraídos de sangre total, lo que indicaría que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.

La producción de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el diagnóstico temprano de niños infectados por VIH.
IgM
Predomina en una primera fase
Es de utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero extraída en el período agudo de la enfermedad.
IgG
Con el transcurso del tiempo aumentan.
se utiliza como técnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
CONCLUSIONES
Las pruebas de diagnóstico viral se han desarrollado de manera importante en los últimos años, nuevas técnicas más rápidas, simples, poco costosas, sensibles y específicas se ofrecen hoy en día, sin embargo, la evaluación de éstas siempre se debe hacer con base en los «estándares de oro» (como los cultivos y la fijación de complemento, etc.) y de acuerdo con una adecuada correlación clínica.
GRACIAS
Katherine Giohana Campos Layza
Estomatología - II Ciclo
Es una técnica de laboratorio que permite amplificar pequeños fragmentos de ADN para estudiarlos e identificar gérmenes microscópicos que causan enfermedades.
Se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar ADN, para lo cual emplea ciclos de alta y baja de temperaturas alternadas para separar las hebras recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, acontinuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarse.
Hoy todo proceso de la PCR está automatizado por un aparato llamado termociclador.
1
Se incuba el suero del paciente con las células infectadas y no infectadas.
2
Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína.
3
El conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente si la reacción es positiva, leyéndose la prueba en un microscopio de fluorescencia.
4
La presencia de Ac se evidencia por la aparición de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las células infectadas, mientras que las células control no fluorescen.
El isotiocianato de fluoresceína es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz verde característica.
Full transcript