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Tips para procesar vegetales para Microscopía Electrónica

Algunos conceptos que hay que tener en cuenta para procesar muestras vegetales y tener éxito.
by

Viviana Sorrivas

on 14 May 2013

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Transcript of Tips para procesar vegetales para Microscopía Electrónica

T.E.M CCTBB, UAT , SNM S.E.M Se puede fijar igual que para TEM o con fijadores coagulantes: FAA, CRAF.
En el caso que sólo se observe la
superficie. ( No para TEM! )
El secado por punto crítico.... es crítico
en la mayoría de los casos. sobre la M.E. de vegetales... y los resultados son: Los procesos se eligen en la mayoría de los casos siguiendo los protocolos que han sido publicados. a veces buenos, a veces malos... Los procesos son semejantes a
los utilizados en animales,
pero hay detalles muy
importantes para tener
en cuenta. La ME en vegetales

Cuándo una célula vegetal está bien fijada?


Algunos tips … Si los tejidos flotan…, la solución es mantener hundida la muestra mediante un peso o colocar en vacío suave con tiempos intermitentes.

Problemas durante la inclusión!
* que no penetre el fijador...
* si tiene sílice en sus tejidos.
* que flote, por tener aire.
* si se requiere observar los pelos ,
glándulas, estomas de la epidermis.
* si es un tejido duro, semillas. 2. Problemas durante la fijación de la muestra Los electrolitos y no electrolitos ayudan a mantener la integridad ultraestructural de la células.

Considerar que los lavados deben tener la misma osmolaridad que la solución fijadora.

Se compensará mediante el agregado al buffer de

NO electrolitos :
* sacarosa
* glucosa

y/o electrolitos :

* cloruro de sodio
* cloruro de magnesio. Cómo ajustar la osmolaridad una vez seleccionada ? 400 mOsM para tejidos meristemáticos ( ejemplo ápice de raíz) . Ej: Hayat, recomienda una osmolaridad de 800 mOsM para tejidos maduros, vacuolados (mesófilo) . Unicelular: célula u organismo aislado
Multicelular: tejido.
o
Acuática : de agua dulce o salada.
Terrestre: tallo , raíz, hoja, a. Tipo de muestra. 1. Qué factores se deberían tener en cuenta al fijar un vegetal? . Un protocolo tipo:
Un tejido vegetal (3,5 mm 2 ) se fija en 6% glutaraldehído en 0.05M tampón cacodilato ( pH7.2) por 24 horas, durante ese tiempo se cambia el fijador 4 veces. Luego se corta en piezas más pequeñas (1mm) se lava 3 veces por 15 a 20 minutos cada lavado en el mismo tampón y se postfija en por 24 horas en tetróxido de osmio al 2% en el mismo buffer. Los especímenes se lavan en el mismo tampón y luego se deshidratan e infiltran en resina Spurr.
Al romperse EL TONOPLASTO se diluye el fijador por eso es una buena idea usar el fijador más concentrado. La primera fijación por ejemplo :5% GA y la segunda 2% de OS O4.

Si la ruptura no fue causada por la fijación puede deberse a causas fisiológicas como: senescencia que precede a la diferenciación celular de organelas como vesículas, túbulos y fibras, enfermedades, muerte celular, deficiencia de nutrientes y daño químico y/o físico. Las membranas están intactas , se asume que se ha preservado la permeabilidad selectiva y que no se ha derramado el contenido vacuolar. Contenido interno aglomerado o aglutinado fijación o deshidratación mala.

Material particulado grande desintegración del espécimen , suciedad o basuras.

Depósitos microcristalinos buffer , fijador o contraste incorrecto. Soluciones:
* Si se ven burbujas rodeando los pelos ... agitar al fijar. * El pH de las vacuolas varía entre
5.0 y 6.0.

* El pH del citoplasma de las mismas células varía entre 6.8 y 7.1. Y el pH óptimo? c. Características del tejido u organelas
que necesito estudiar:

Células aisladas, marinas o de agua dulce? Tejido… meristemático?, parénquima esponjoso?, cortical?, xilema?, floema?, etc… b. Tamaño: micrones o milímetros?
1.-Qué factores son los más importantes a tener en cuenta en el procesamiento de vegetales?

2.-Qué problemas pueden presentarse durante el procesamiento de tejidos vegetales?

3.-Qué artefactos pueden producirse en el tejido durante el procedimiento ?

4.- Algunas soluciones. Las vacuolas contienen enzimas hidrolíticas como nucleasa y proteasa , si se rompe el tonoplasto son diseminadas por el citoplasma cambiando la ultraestructura.


Una célula vegetal bien fijada tendrá su tonoplasto perfectamente continuo y distinguible del resto. *Los granos densos se resisten a ser embebidos y por lo tanto no se impregnan.

*Cuando las secciones flotan en agua, el grano de almidón se hidrata e hincha y desarrolla pliegues. Un artefacto muy común en almidón Aparecen invaginaciones en
el plasmalema con vesículas
Barra: 1μ. En el xilema… d) osmolaridad de la soluciones
fijadoras y buffer. Control del pH.
A las células vegetales terrestres conviene sumergirlas en una solución hipotónica por un tiempo para que se logre el equilibrio antes colocar gradualmente el fijador osmóticamente más fuerte . Problemas osmóticos Fijación pobre de REG 3. Problemas en la fijación Solución fijadora:
Glutaraldehído 25% …………………15ml
Formaldehído………...........................25ml
Tampón cacodilato (0.2M, pH 7,2) ….18ml
Ca Cl 2 ……………………………...25mg Sellar con lanolina Prof. 0.5cm 2,5cm de diám. Para lograr una buena fijación realizarla inmediatamente después de la extracción de la muestra. 1 hora a T° amb 100 ml de agua
destilada + 0.5 ml. de ácido sulfúrico 5 ml de ácido fluorhídrico * Si posee alto contenido de sílice Nunca dejar al aire la muestra mientras se está deshidratando!! Tomar en consideración el tamaño del
especímen para
realizar los venteos. Los puntos más importantes son utilizar la osmolaridad correcta para cada tipo de espécimen y superar los problemas de infiltración... otros artefactos... Cómo optimizar el procedimiento? Gracias por tu atención! * Cómo se selecciona la osmolaridad óptima para fijar el tejido de interés? observemos... Bacterias en la cara abaxial de una hoja
a) Tipo de muestra.
b) Tamaño.
c) Características del tejido u organelas.
d) Osmolaridad del tejido. gentileza Dra. Patricia Leonardi observación a bajo potencial . Cuidado en el montaje ugh ! de herbario, no hidratado! Hay que hidratarrrr! pelo glandular el pelo abollado seguramente ya estaba así... Levaduras se observa el rectángulo donde se hizo foco! Esporas de Chara y bacterias
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