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Metodología Molecular Sosa

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by

maria de los angeles sosa

on 29 June 2016

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Transcript of Metodología Molecular Sosa

Bqca. Maria de los Angeles Sosa
Personal de Investigación SGCyT
Instituto de Medicina Regional
UNNE
Resistencia Chaco
Metodología molecular
85%
Técnicas moleculares
Objetivos
Columna de extracción
Pasos generales
Separación y Purificación
Precipitación del ADN
Resuspensión del ADN
Chequeo del ADN
Organización de la jornada de trabajo
No intercambiar pipetas
cabina con UV.
paredes de metal y metacrilato.
cabinas de bioseguridad: agentes patógenos
Problemas

Lograr la disponibilidad de los Ácidos nucleicos
Remover sustancia inhibitorias
Concentrar los ácidos nucleicos

Extracción y Purificación de ADN
Amplificación
Detección
Lisis de envolturas
Físicos
: perlas de vidrio, sonicación, hervido, shock térmico
Enzimas
: Lizosima, Proteinasa K
Detergentes
(CTAB, SDS)

Solventes orgánicos

Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico



Separación de una fase acuosa rica en Ácidos nucleicos

Interpretación

Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos díficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todavía ser amplificado.
Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo.


Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos

Falsos positivos debido a contaminación.

Fuentes frecuentes:
- de contaminación entre muestras -otras muestras clínicas que contienen un número elevado de secuencias blanco-
de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores
de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia.

Conclusiones

CONDICIONES EXPERIMENTALES A TENER EN CUENTA….

Columna de cromatografía
Una rápida alternativa a métodos laboriosos de preparación de ADN de alta calidad.

Utiliza una única resina de intercambio aniónico, que selectivamente enlaza ácidos nucleicos, separándolos rápidamente de contaminantes como RNA, proteínas, carbohidratos, y metabolitos.

Contaminantes son separados al lavar la columna con una solución amortiguadora de baja concentración de sales y posteriormente será eluido el DNA con una solución amortiguadora de alta sal.

Productos PCR con errores

Baja fidelidad de la enzyme (Taq polymerase vs Pfu)
mucho/poco MgCl afecta correcciones de la polymerase


Errores en la PCR

Amplicón del tamaño incorrecto
Problemas en el diseño del primers
Problemas en el apareamiento del primer
Baja temperatura de annealing

Ausencia de producto de amplificación
No se produce apareamiento con los primers
Muy alta temperatura de annealing
Primer dimero
Mucha cantidad de molde
No inclusión de la enzyme en la mix
de dNTPs
mucho/poco MgCl2


Cuánto discrimina un gel?

Descontaminación

Es muy importante en todas las superficies de trabajo, así como pipetas, antes y después de utilizar un área de trabajo.

Para ello, el medio más habitual es el hipoclorito sódico al 5-10% o etanol 70%, aunque existen formulas comerciales para este cometido.

Utilización
del área

Descontaminación

CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES.

Área de recepción de muestras
y extracción de ácidos nucleicos

Área de análisis de amplificados

Área de preparación de reactivos

La contaminación por DNA es el principal motivo que hace que la labor en unas instalaciones de PCR para diagnóstico deba ser muy meticulosa.

Por ello, es conveniente diferenciar áreas de trabajo, que estén en habitaciones diferentes o, si no es posible, lo suficientemente alejadas para evitar este problema que puede repercutir en dar resultados falsos positivos.

¿En qué consiste el método de columnas?

CORRIDA ELECTROFORETICA

SIEMBRA DE LA MUESTRA

PREPARADO DEL GEL

Muestra
Buffer de siembra (ej: ABF)
densidad
marca frente de corrida

Agarosa
Buffer de corrida (ej:TBE)

Interpolo fragmento de PM desconocido

Marker de 1Kb

10000 pb

9000 pb

8000 pb

7000 pb

6000 pb

5000 pb

4000 pb

3000 pb

2000 pb

1000 pb

Dist

Log PM

A MAYOR PM MENOR MIGRACION

A igual carga neta Diferencia por PM

Cómo discrimina un gel?

(+)

(-)

(+)

(-)

MIGRA AL POLO (+)

Cc conocida

Se corre a pH básico o neutro ADN carga (-)

Matriz semisólida: GEL de AGAROSA
Visualización al UV: Bromuro de Etidio

CANTIDAD

INTEGRIDAD

ELECTROFORESIS

Chequeo del ADN obtenido

Componentes estructurales
quitina (rojo)
ß-1,3-D-glucano (verde)
ß-1,6-D-glucano (azul)
mananos (negro)
proteínas (naranja)

Alcoholes
: constante dieléctrica

Sales
: Apantallan las cargas
En agua o buffer TE
Elución con TE o Agua

Lavado 1

Carga de la columna


Buffer de lisis + muestra

Consideraciones experimentales
a tener en cuenta....

La jornada de trabajo debe organizarse de forma que el flujo de trabajo comience por las áreas más “limpias” y acabe por el análisis de amplificados, evitando invertir este orden. Asimismo, es conveniente contar con batas exclusivas para cada área.

Análisis de
amplificados

Extracción
De
ácidos
nucleicos

Preparación
de
reactivos

Un aspecto muy importante es tener un juego de pipetas en cada área de trabajo, evitando el intercambio de las mismas.

Asimismo, en las áreas de preparación de reactivos y de extracción de DNA/RNA es imprescindible utilizar puntas estériles con filtro, para evitar la contaminación del extremo de la pipeta.

En el caso de RNA, además deben estar libres de RNAasas, por lo que es preferible adquirirlas ya estériles.

Uso de campanas
CORRIDA ELECTROFORETICA

SIEMBRA DE LA MUESTRA

Muestra
Buffer de siembra (ej: ABF)
densidad
marca frente de corrida

Agarosa
Buffer de corrida (ej:TAE o TBE)

PREPARADO DEL GEL

(-)

MIGRA AL POLO (+)

(+)

Se corre a pH básico o neutro ADN carga (-)


INTEGRIDAD


Chequeo del ADN obtenido por electroforesis

CANTIDAD

Matriz semisólida: GEL de AGAROSA

Visualización al UV:
Bromuro de Etidio o Syber green

Microcentrífuga para tubos Eppendorf

Vórtex

Baño térmostatizado
(también es válido un termobloque)

¿Qué equipos necesitamos en extracción de ADN?

Es conveniente tener un termómetro de máximos y mínimos para comprobar si existe fluctuación de temperatura y evitar el deterioro de reactivos y muestras.

El congelador de –20ºC permite el almacenamiento de muestras de DNA extraído. Para el RNA y conservación a largo plazo de DNA es necesario un congelador de –70ºC

TIPS
Cuanta menor sea su manipulación, menor riesgo de contaminación
Por ello, se recomienda adquirir tips libres de DNAsas y RNAasas

Se requieren tubos Eppendorf o de microfuga, de diversos tamaños:

1,5 mL (para muestras)
0,5 mL

GUANTES!!!!
¿Qué material fungible se utiliza en esta área?

Productos PCR con errores

Baja fidelidad de la enzyme
(Taq polimerasa vs Pfu)
mucho/poco MgCl2
afecta correcciones
de la polimerasa


Errores en la PCR
Amplicón del tamaño incorrecto
Problemas en el diseño del primers
Problemas en el apareamiento del primer
Baja temperatura de annealing

Ausencia de producto de amplificación

No se produce apareamiento con los primers
Muy baja o alta temperatura de annealing
Dímero primer
Mucha cantidad de ADN molde
No inclusión de algún reactivo en la mix
mucho/poco MgCl2


Falsos positivos:

- contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores
- contaminación entre muestras

Falsos negativos
:
- Bajo inoculo
- Inhibición de la PCR
de la muestra(Heparina, Hemoglobina, sales biliares)
de la extracción de ADN (exceso de NaCl, fenol, etanol)


Espectrofotómetro UV
Luminómetro
Electroforesis
Lavado 2
ADN
Preparación de Mix PCR
UNIDIRECCIONALIDAD
Problemas
Descontaminación
Conservación
Objetivo
Aumentar exponencialmente el número de copias de ácidos nucleicos presentes en la muestra
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