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Ignacio Mastandrea Trías

on 21 November 2012

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Introducción La glicación es un proceso no enzimático que involucra la modificación postraduccional permanente de las proteínas tras reaccionar grupos nucleofílicos de las mismas y electrófilos como la glucosa y otros azúcares reductores. Factores determinantes Concentración de reactivos

Tiempo

pH

Temperatura Consecuencias Productos finales de la glicación (AGE's) traen
aparejados Propuesta Metodológica A1: Estudio de la reactividad de las Lisinas presentes en el péptido representativo
A2: Comparación estabilidad y reactividad de isómeros lineales y cíclicos
B1: Determinación de energías de reacción para el mecanismo de formación del producto de Amadori
B2: Determinación de energías de activación para el mecanismo de formación del producto de Amadori Estudio de las transformaciones estructurales de la albúmina resultantes de la glucosilación no enzimática Equipo Mi3
Santiago Mansilla
Ignacio Mastandrea
Gabriel Otero
Alejandro Rodríguez
Noé Seija Análisis Mecanismo Complicaciones en la diabetes Insuficiencia renal Aterosclerosis Problemas cardiovasculares Mal de Alzheimer y Parkinson Seroalbúmina Humana -Vida media de 3 semanas
-66 KDa
-Principal proteína sérica
-Mayor exposición a compuestos carbonílicos reactivos Antecedentes Optimización de todas las especies con DFT con funcional extendido wB97XD, utilizando conjunto de base mediano (6-31G*)
Nueva optimización con Moller-Plesset (método post HF)
Varios single point utilizando bases mayores y otros funcionales OBJETIVOS
Se definen 3 principales para el proyecto Objetivo 1 Determinación de la región más reactiva de la proteína (polipéptido representativo)
Comparación de reactividad de residuos de lisina en polipéptido Ilustración tomada de http://es.wikipedia.org/wiki/Alb%C3%BAmina, enciclopedia libre, 18/11/2012 Modelado con ACD/ChemSketch 11.02, Advanced Chemistry Development, Inc. Copyright © 1994-2008. Imagen tomada de AstroyCiencia.com, Web dedicada a la astronomía educativa y la ciencia, 18/11/2012 H2O cumple rol fundamental estabilizando estados de transición Objetivo 2 Caracterización de especies estables y estados de transición involucrados y determinación de propiedades fisicoquímicas relevantes (Energía de activación y Energía de reacción) con el mayor grado de exactitud posible. Objetivo 3 Comparación de estabilidad de glucosa, base de Schiff y producto de Amadori entre sus formas abierta y cerrados. Protocolo de trabajo Propiedades Fisicoquímicas Reactividad de residuos de lisina
Estabilidad y reactividad isómeros lineales y cíclicos
Energías de reacción y activación Sistemas Moleculares Visualizado con Discovery Studio v3.5.0.12158, Accelrys Software, Inc. © 2005-2012.
Extraído de pdb.org Visualizado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Antecedentes A determinar Modelo de Glioxal y Metilamina A1: Estudio de la reactividad de las Lisinas presentes en el péptido representativo A2: Comparación estabilidad y reactividad de isómeros lineales y cíclicos Optimización geométrica: elección de un método semiempírico (carga 0, multiplicidad 1), dado grado de exactitud requerido y costo computacional. Una parametrización PM3 sería la más adecuada, debido a lo bien que contempla la formación de EDH, como los que se forman en moléculas de este tipo B1: Determinación de energías de reacción para el mecanismo de formación del producto de Amadori Energía de reacción de cada una de las etapas: da idea de la termodinámica de la reacción. Al involucrar las reacciones estudiadas ruptura y formación de nuevos enlaces se hace uso de un método cuántico. B2: Determinación de energías de activación para el mecanismo de formación del producto de Amadori Energías de activación: da idea de la cinética de la reacción. Necesidad de caracterizar estructuras de TSs.
--> Búsqueda de una buena estructura de partida interpolando estructuras de reactivos y productos en el reaction map. A1: Estudio de la reactividad de las Lisinas presentes en el péptido representativo 1. Obtener la estructura de la HSA desde la base de datos PDB y editar la estructura hasta obtener únicamente el decapéptido deseado a pH fisiológico
2. Definir la frontera mecánico-cuántica, fijar los átomos clásicos y luego definir el método semiempírico a utilizar para uno de los residuos de lisina.
3. Realizar el cálculo single point
4. Visualizar los orbitales y calcular el gap Homo-Lumo. Registrar en la tabla A1
5. Repetir los pasos para el otro residuo de lisina y comparar los valores A2: Comparación estabilidad y reactividad de isómeros lineales y cíclicos 1. Dibujar la estructura lineal de la d-glucosa y optimizar su geometría utilizando un método cuántico semiempírico PM3. Registrar datos de energía en la tabla A2
2. Visualizar los orbitales moleculares y calcular gap Homo-Lumo. Registrar en cabla A2
3. Repetir los pasos para la d-glucosa en su forma cerrada y comprar los valores obtenidos
4. Este obtenido también debe realizarse para las formas lineal y cíclica de la base de Schiff y el producto de Amadori B1: Determinación de energías de reacción para el mecanismo de formación del producto de Amadori 1. Cargar la estructura optimizada de la d-glucosa lineal y realizar un cálculo single point con un método semiempírico ZINDO/1. Registrar la energía en la tabla B1
2. Obtener la ZPVE y registrar su valor
3. Realizar un cálculo single point para el decapéptido en las mismas condiciones que la glucosa.4. Repetir los pasos para la determinación de la ZPVE
5. Recuperar la estructura de la carbinolamina y definir la frontera mecánico-cuántica, fijar los átomos clásicos y luego definir el método semiempírico a utilizar
6. Optimizar la geometría y anotar el valor de la energía en B1
7. Obtener el valor de la ZPVE con el mismo método que en la parte anterior y registrar su valor
8. Repetir este procedimiento para los demás aductos B2: Determinación de energías de activación para el mecanismo de formación del producto de Amadori 1. A partir de las estructuras y la glucosa y el péptido, generar una estructura de partida para la optimización del primer TS
2. Repetir el procedimiento para las estructuras de partida para la optimización de los otros TS's
3. Recuperar la estructura inicial del primer TS y buscar el vector propio que deberá seguirse, mediante el método Eigenvector following (recordar utilizar método mixto, fijando fronteras análogas a las etapas anteriores). Al converger el cálculo registrar el valor de la energía en la tabla B2.
4. Repetir el procedimiento para los demás TS's
5. A partir del espectro vibracional calcular la ZPVE de cada TS y registrar su valor en la tabla B2.
6. Con los datos recabados calcular las energías de activación Albúmina y lisinas más lábiles a la glicación Decapéptido de Interés
comprendido entre Glu-520 y Val-530 d-Glucosa (lineal) d-Glucosa (cíclica) Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Homo Lumo d-Glucosa lineal d-Glucosa cíclica Posibles TS's A1 Observamos un menor gap HOMO – LUMO para el residuo de lisina 525, por lo que se espera que esta sea la más reactiva. Al considerar el área expuesta de cada residuo se observa que para la Lys 524 esta área es nueve veces mayor, pero de todos modos la bibliografía demuestra que la Lys 525 es la más propensa a reaccionar A2 En base a los resultados obtenidos observamos que la forma abierta de la glucosa es la menos estable y además la más reactiva, como esperábamos B1 Como podemos observar, el valor de Ereacción es positivo, por lo tanto el primer paso de la reacción es endotérmico. Si bien no podemos tomar esto como un valor exacto (por limitaciones del programa sobre todo), es útil como referencia de la termodinámica de la reacción B2 Debido a dificultades con el programa utilizado no se pudo obtener los estados de transición y las energías de activación, pero presentamos estructuras que creemos posibles. En las mismas se tuvo en cuenta el papel catalizador del agua, para observar las diferencias Muchas Gracias "Moderate glycation of serum albumin affects folding, stability, and ligand binding", Vetter S., Indurthi V., Clinica Chimica Acta, 2011, vol 412, pág 2105–2116 "Moderate glycation of serum albumin affects folding, stability, and ligand binding", Vetter S., Indurthi V., Clinica Chimica Acta, 2011, vol 412, pág 2105–2116 "Glycated lysine residues: A marker for non-enzymatic protein glycation in age-related diseases", Ansari N, Moinuddin, Ali R., Disease Marker, 2011, vol 30, pág 317-324 "Moderate glycation of serum albumin affects folding, stability, and ligand binding", Vetter S., Indurthi V., Clinica Chimica Acta, 2011, vol 412, pág 2105–2116 "Theoretical studies on models of lysine-arginine cross-links derived from a-oxoaldehydes: a new mechanism for glucosepane formation", Nasiri R., Zahedi M, Jamet H., Moosavi-Movahedi A, J Mol Model, 2012, vol 18, pág 1645–1659 Theoretical studies on models of lysine-arginine cross-links derived from a-oxoaldehydes: a new mechanism for glucosepane formation", Nasiri R., Zahedi M, Jamet H., Moosavi-Movahedi A, J Mol Model, 2012, vol 18, pág 1645–1659 "Advanced Protein Glycosylation in Diabetes and Aging” Brownlee M., Annu. Rev. Med., 1995, vol 46, pág 223–234 “Cross-linking Mechanisms of Arginine and Lysine with ,-Dicabyl Compounds in Aqueous Solution”, Nasiri R., Field M., Zahedi M., Moosavi-Movahedi A., The Journal of Physical Chemistry, 2011, vol 115 (46), pág 13542-55 “Cross-linking Mechanisms of Arginine and Lysine with ,-Dicabyl Compounds in Aqueous Solution”, Nasiri R., Field M., Zahedi M., Moosavi-Movahedi A., The Journal of Physical Chemistry, 2011, vol 115 (46), pág 13542-55 “The glycation of albumin: Structural and functional impacts”, Rondeau P., Bourdon E., Biochimie, 2011, vol 93, pág 645-658 Modelado con ACD/ChemSketch 11.02, Advanced Chemistry Development, Inc. Copyright © 1994-2008. Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc.
Proteína extraída de pdb.org “The glycation of albumin: Structural and functional impacts”, Rondeau P., Bourdon E., Biochimie, 2011, vol 93, pág 645-658 Imagen tomada de http://www.rcsb.org/pdb, Base de datos de
proteínas, RSCB, 18/11/2012 Primera aproximación a los TS Nota: No se incluye al agua como catalizador Modelado con ACD/ChemSketch 11.02, Advanced Chemistry Development, Inc. Copyright © 1994-2008. Carbinolamina Como ejemplo de uno de los intermediarios del proceso Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Reactividad de residuos de lisina Determinar gap HOMO-LUMO
GapHL = Elumo - Ehomo. Evaluación áreas expuestas de los residuos. Estabilidad y reactividad isómeros lineales y cíclicos Determinar gap HOMO-LUMO GapHL = Elumo - Ehomo. Determinar energía total. Energías de reacción y activación Ereacción = Eproductos - Ereactivos. -> Caracterización reactivos y productos. Eactivación = Ets - Ereactivos.
-> Caracterización de estados de transición (TS) Incluir ZPVE Determinar gap Homo-Lumo
Propiedad que requiere de detalle electrónico, condiciona elección de método cuántico. Aplicación de método mixto (QM/MM)
Con el fin de obtener los orbitales de las lisinas por separado de las Lys-524 y Lys-525 por separado y contemplando las dimensiones del sistema, debemos aplicar un método mixto de frontera cuántico-clásica (QM/MM). Aspectos a tener en cuenta... Determinar frontera: residuo de lisina extendida al backbone (extendemos frontero hasta enlace sp3-sp3) Modelado con HyperChem 8.0.8, Windows Molecular Modeling System, Copyright © 1995-2009 Hypercube, Inc. Elección campo de fuerza: AMBER, conveniente, desarrollado para la descripción de sistemas grandes como proteínas y ácidos nucleicos. Única posibilidad que ofrece HyperChem. Elección método cuántico: explicitar carga (+1) y multiplicidad (1) del sistema. Imposibilidad de elegir ab-initio en este caso, se opta por un semiempírico (no se necesita elegir conjunto de base). Debido a limitaciones del programa se opta por una parametrización ZINDO/1 Cálculo single-point: se resuelve la Ecuación de Schrödinger a posiciones nucleares fijas, se obtiene la
energía del péptido (de utilidad más adelante) y las energías orbitales, pudiendo determinar para ambas lisinas el gap HOMO-LUMO. Una vez terminada la optimización, obtenemos gap H-L y energía total de los isómeros Cálculo single-point: se procede al final a realizar un single-point con ZINDO/1 para obtener esos mismos datos pero con otra parametrización para que la información obtenida sea de utilidad más adelante, no a los efectos de esta parte Aspectos a tener en cuenta Implementación método mixto: frontera clásico-cuántica similar, incluyendo al aducto formado extendida al backbone del péptido. Campo de fuerza implemetado: AMBER
Método cúantico implementado: semiempírico, parametrización ZINDO/1 Exactitud Inclusión de ZPVE, obtenida a partir del espectro vibracional de las especies involucradas. Debería incluirse la correlación electrónica, impedido por limitaciones del software empleado. La variable Lambda define que tanto se parece el TS a los reactivos o a los productos y se puede aproximar a partir de la energía de reacción, valiéndose del postulado de Hummond. Luego de obtenida dicha estructura inicial se procederá a optimizarla mediante un método Eigenvector following, tras haber fijado la frontera cuántico-clásica tal como se hizo en las etapas pasadas. Valores de energías orbitales de residuos de Lisinas y su correspondiente gap HOMO-LUMO. Energías de totales y orbitales de los isómeros cíclicos y lineales (para estudio comparativo de isómeros) . Energías TSs y Energías de activación
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