Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Eigen ELISA

No description
by

Brecht Vandekerckhove

on 14 May 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Eigen ELISA

Finally Doel Eigen directe methode ELISA Bepalen van de optimale concentratie bovine IgG voor de coating om een voldoende sterk signaal te verkrijgen zonder verspilling Principe Welletjes coaten met 1/2 verdunningsreeks antigeen bovine IgG




Welletjes blokkeren met BSA Principe Kleurintensiteit is RE met gebonden anti-bovine IgG-AP

Controles: Principe Anti-bovine IgG-AP toevoegen





Substraat toevoegen Werkwijze - buffers Grégoire Fauvarque
Brecht Vandekerckhove Coating IgG (500 µg/ml):
50 µl stockoplossing (10 mg/ml) aanlengen met 950 µl coatingsbuffer Coatingsbuffer: 50 mM carbonaat -bicarbonaat pH 9,6
Na2CO3 1,59 g
NaHCO3 2,93 g
Oplossen in 1 l AD Wasbuffer: PBS, 0,05% Tween-20 pH 7,4
50 µl 50 % Tween -20 bij 49,95 ml PBS Stoppingsbuffer: 3 M NaOH
12 g NaOH in 100 ml A.D. pNPP substraatoplossing: 1 mg/ml
tablet van 5 mg oplossen in 5 ml glycinebuffer Glycinebuffer: 0,1 M pH 10,4
7,51 g glycine
203 mg MgCl2
136 mg ZnCl2
Oplossen in 980 ml A.D.
Op pH brengen (tot 1l) 1:1000 verdunningsbuffer anti-IgG:
5 µl stock aanlengen met 4995 µl blokkeringsbuffer Blokkeringsbuffer:
0,1 g BSA oplossen in 20 ml carbonaatbuffer(0,5%BSA) Werkwijze - coaten In duplo: een nacht incuberen op 4 °C Werkwijze - blokkeren 300 µl blokkeringsbuffer in elke well
30 min incubatie op 37 °C
Oplossing weggieten
3x wassen met 300 µl wasbuffer Werkwijze - detectie AL 100 µl anti-IgG AL toevoegen behalve in controles 1 (controle welletjes met coatingIgG)
30 min incubatie op 37 °C
5x wassen met 300 µl wasbuffer
100 µl substraatopl. toevoegen
15 min incubatie
100 µl stopreagens toevoegen
Meten bij 405 nm met de microplate reader Resultaten: Bedankt voor uw aandacht grafiek van de resultaten deze concentraties aan IgG geven te lage absorbanties , ongeveer gelijk aan absorbantie van negatieve controles deze concentraties aan IgG zijn te sterk en geven geen veranderende absorbanties concentraties binnen het lineair gebied die voldoende groot zijn voor voldoende sterk signaal Besluit: 3x wassen met 300 µl wasbuffer Oplossing weggieten hieronder zijn de gemeten absorbanties van de verdunningsreeks te zien: de absorbanties van de controles: een concentratie aan bovine IgG waarmee gecoat kan worden , die een voldoende sterk signaal levert en die binnen het lineair gebied gelegen is, is 125 µg/l er waren geen andere zaken in gebruikte oplossingen die voor substraatomzetting hebben gezorgd =OK! AL binden niet aspecifiek op de welletjes = OK!
Full transcript