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HPLC

Martín Paolo Soto
by

Martin Soto

on 11 June 2014

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Transcript of HPLC

Cromatografía de líquidos de alta eficiencia
HPLC
Soto Aceves Martín Paolo
FASE MÓVIL


Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se
denomina una
elución isocrática
. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se
aumenta notablemente por una
elución con gradiente
. En este caso se utilizan dos (y a
veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza
la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces
continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas.


La cantidad de muestra
(10 μg de muestra) también afecta a la eficacia de la columna.

Para las
aplicaciones de adsorción, la eficacia decrece notablemente con
la cantidad de muestra.
Presión
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño
de partícula entre 3 y 10μmicras, que, por otra parte, son comunes en la moderna
cromatografia de líquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por
centímetro cuadrado.
Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con
tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme.

La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud
entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es
necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a
menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son
3, 5 y 10 μm.
partículas porosas
Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos están
formados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 micras y con la menor
dispersión posible para un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina o
resinas de intercambio iónico, aunque la
sílice
es el material más común.
pelicular
bolas de vidrio o de polímero,
no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 μmicras. En la
superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de
una resina de intercambio iónico. se usa en precolumnas.

En ocasiones se cubren con fase estacionaria líquida
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos.

Los
detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la
fase móvil:
índice de refracción
detectores electroquímicos

Por contraste, los detectores basados en
una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto:
Absorbancia UV
Absorbancia IR
Fluorescencia
detectores
metanol/ agua (50:50)
+ metanol/ agua
aplicaciones
campo de aplicación es muy numeroso debido a :

su sensibilidad
su fácil adaptación a las deteminaciones cuantitativas
su idoneidad para la separación de especies no volátiles termolábiles
su gran aplicabilidad en sustancias de interés industrial y en la ciencia.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
se prefiere por su mayor capacidad de carga y su gran diversidad de presentaciones
cromatografía de reparto
cromatografía de adsorción
cromatografía de intercambio iónico
cromatografía de exclusión por tamaños
fase estacionaria
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