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PCR EN TIEMPO REAL PARA LA CUANTIFICACIÓN DE EXPRESIÓN DE GE

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by

Jennifer Fiallos

on 3 February 2014

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Transcript of PCR EN TIEMPO REAL PARA LA CUANTIFICACIÓN DE EXPRESIÓN DE GE

PCR EN TIEMPO REAL
PARA LA CUANTIFICACIÓN DE EXPRESIÓN DE GENES
Desarrollar en mayor detalle la técnica de PCR en Tiempo Real.
Comprender las bases del diseño experimental de un experimento para cuantificación de expresión de genes.
Utilizar sets de primers para genes distintos (un gen
housekeeping
y un gen
target
) para obtener productos de PCR cuantificables.
OBJETIVOS
La capacidad de determinar, de forma absoluta o relativa, la cantidad de moléculas blanco iniciales presentes en una muestra a ser analizada.
qRT-PCR
CUANTIFICACIÓN
ABSOLUTA
CUANTIFICACIÓN
RELATIVA
Se compara el valor Ct de las muestras respecto a una curva estándar.

La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida en el PCR en tiempo real vs. el número inicial de copias de una secuencia en una muestra utilizando una curva de calibración.

Las curvas de calibración tienen que ser rigurosamente validadas con absoluta exactitud pues la cuantificación de la expresión genética en la PCR en tiempo real depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados.
La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones determinadas.

Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de referencia (housekeeping).

La elección correcta de los genes de referencia para la normalización de PCR a tiempo real es esencial para reflejar datos fiables sobre los procesos biológicos de los genes objeto de estudio.
Ct
valor
CUANTIFICACIÓN
ABSOLUTA
Un médico está interesado en determinar el número de partículas virales por mL de sangre de un paciente.

Extracción de ADN a partir de la muestra de sangre del paciente.

Se realiza un ensayo de PCR-Tiempo real con primers específicos para una secuencia de ADN viral.

Comparar el valor Ct obtenido para la muestra con una curva estándar en base a concentraciones conocidas de partículas virales.

Interpolando resultados se determina la carga viral por mL de muestra.
Curva de calibración
CUANTIFICACIÓN
RELATIVA
CURVA ESTÁNDAR
Para construir una curva estàndar se necesita disponer de una muestra patrón con concentración conocida a partir de la cual se realizan diluciones seriales.

La muestra de concentración desconocida es analizada en una misma corrida junto con los estándares.

Los resultados finales se obtienen mediante interpolación con las concentraciones conocidas de los estándares.

La cuantificación absoluta mediante qRT-PCR se aplica comunmente para:
Determinar el número de copias de un gen
Determinar carga viral en una muestra
Un investigador quiere determinar si los niveles de expresión de la proteína p53 difieren entre células cancerígenas y celulas no cancerígenas, y en caso de existir diferencia, cuán diferente es la expresión.

Debe determinar los niveles de mRNA del target p53 en ambos tipos de tejidos y obtener una relación de la expresión expresada en "Fold Difference".

Emplear un gen de referencia (housekeeping gene) cuya expresión no varíe entre ambos tejidos.

Extracción mRNA - análisis qRT-PCR

Los resultados finales se normalizan con los resultados del gen de referencia.
Genes de referencia
2–DDCT (Livak) method
Diseño experimental de un análisis de expresión genética
Quinoa
Los resultados de expresión relativa se obtienen a manera de "Fold Changes" o "Fold Differences".




Es una medida que describe cuánto varía una cantidad desde un punto inicial hasta un punto final.
EJ.: un valor inicial de 30 y un valor final de 60 corresponden a un "Fold Change" de 2.
Los genes de referencia son genes cuya expresión es estable en las células, es decir, no varían su expresión bajo las condiciones experimentales.

Muchos de estos genes son indispensables para la supervivencia celular y son utilizados para validar los estudios de expresión relativa.

Se han desarrollado varios modelos matemáticos para el cálculo de la expresión génica relativa.
El método del ddCt es un modelo matemático que calcula los cambios en la expresión génica como una diferencia entre una muestra experimental y una muestra calibrador.

Este método es muy útil y es de mayor uso por parte de investigadores, además que los softwares de los equipos de PCR en tiempo real incluyen este método por default.

Este método no requiere la elaboración de una curva estándar, lo que lo hace muy útil para el análisis de una gran cantidad de muestras evitando el uso de estándares diluidos.
"FOLD CHANGES"
EXPRESIÓN DIFERENCIAL
ESTÍMULOS
CONTROLES INTERNOS
6 VARIEDADES
Metiljasmonato
Controles (H2Od)
mRNA
cDNA
cDNA-AFLPs
Bandas diferenciales
8h y 24h
Secuenciación
BIOINFORMATICA
Primers
Específicos
Housekeeping genes
qRT-PCR
GENE DISCOVERY
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