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E coli O157

E coli O 157:H7 in raw milk
by

Victor Estacio

on 30 October 2012

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Transcript of E coli O157


Con relación a la determinación de coliformes los resultados indican que el nivel de coliformes encontrado, promedio de 100 000 coliformes por mililitro, supera el nivel aceptado por la Norma Técnica Sanitaria N°071 – MINSA/DIGESA-V.01 (62) de Lecha cruda sin pasteurizar que presenta un nivel de máximo de 1000 coliformes por mililitro (81). El alto nivel de coliformes encontrado puede ser un indicador de condiciones no higiénicas en el manejo de la leche cruda de establo (82) a su vez es reconocido como un indicador de sanitización en el lugar de producción, aun cuando el proceso de pasteurización elimina estas bacterias, el hallazgo de Coliformes en productos pasteurizados indica que la contaminación ha ocurrido después de este proceso durante la manufactura o empacado (83). Discusión de resultados Estas observaciones conducirían a un cambio en las metodologías de aislamiento de las E. coli portadoras de verotoxinas que siguen tomando solamente características como la fermentación del sorbitol y la búsqueda de serotipos específicos como la O157:H7, para ampliar el espectro de cepas portadoras de las toxinas específicas.
Al respecto de los casos de E. coli verotoxigenicas que no pertenecen al serotipo O157:H7, entre Mayo y Junio del 2011 se presentó un caso de infección por consumo de verduras contaminadas con un tipo de E. coli especificado como O104:H4 que contenía las verotoxinas, en este brote 2987 presentaron gastroenteritis aguda de los que murieron 18 y 855 personas presentaron Síndrome Urémico Hemolítico. La fuente de contaminación fue identificada como semillas contaminadas provenientes de Egipto y se observaron casos en países como Francia y Estados Unidos. Esto evidenció que deben de tomarse las adecuadas medidas de higiénicas por los manipuladores de alimentos y los consumidores en todo momento; por otro lado los reportes y la investigación de las enfermedades de transmisión alimentaria aseguran una respuesta eficaz por parte de las autoridades en el control de las enfermedades (80). Discusión de resultados
Siendo la técnica de PCR el método confirmativo para la determinación de toxinas, no se empleó para en el análisis, ya que no se tenía probabilidad de encontrar otros factores de virulencia accesorios tales como eaeA+ gen de la intimina, γ-tir+ gen del receptor translocado de intimina, rfbE+ gen del serotipo O157, fliC+ gen del serotipo flagelar H7, hlyA+ gen de la hemolisina (2).
La ausencia de las Verotoxinas en alguna cepa de E. coli limita su toxigenicidad relacionada con la incidencia de la diarrea hemorrágica y SUH (64). La no presencia de cepas con el serotipo O157:H7 no excluiría de su potencial patogénico ya que se han presentado casos de la enfermedad asociada con este serotipo (77), algunos de estos casos están asociados con características bioquímicas distintas a las seguidas en el método para aislar el serotipo O157:H7 como son la fermentación del sorbitol (78), además se sugiere que la infección con cepas fermentadoras de sorbitol y de serotipo O157 resultaría en enfermedad menos severa lo que llevaría a un menor riesgo renal asociado (79). Discusión de resultados Otro de los componentes de la leche que tiene poder inhibitorio sobre las bacterias es la lactoferrina, una glicoproteína no hémica de unión a hierro perteneciente a la familia de las transferrinas. Esta presente en una variedad de fluidos exocrinos y es particularmente abundante en leche y calostro.
La lactoferrina es un componente de los mecanismos innatos de defensa del hospedero, ya que exhibe actividades antibacterianas y por su estratégica presencia en las secreciones diseminadas sobre las superficies mucosas que continuamente están expuestas al contacto con bacterias patógenas(75).
Se sabe también que a pesar de la poca presencia de este patógeno en leche, para E. coli O157:H7, la dosis infectiva es baja, entre 10 y 700 células (media < 100 células). Para los serogrupos no O157, se desconoce y sería precisa más investigaciones (75). Discusión de resultados Este sistema es más efectivo cuando el inoculo inicial y la temperatura son bajos, condiciones existentes en un tanque de almacenamiento, en donde la leche es mantenida a temperatura cercana a 3 °C y en donde cabe esperar, además, una baja concentración de E. coli O157:H7 debido al efecto de dilución. Sin embargo, varios trabajos han demostrado la capacidad de E. coli O157:H7 para sobrevivir en productos lácteos fermentados y quesos, por lo cual la presencia de E. coli O157:H7 en leche destinada a la fabricación de estos productos, aun cuando se encuentre en bajas concentraciones, puede constituir una amenaza a la salud del consumidor (18).
Los efectos que tiene la lactoperoxidasa sobre la célula bacteriana son: inhiben el crecimiento, inhiben la toma de oxígeno, inhiben la producción de ácido láctico, inhiben la acción enzimática de la hexoquinasa (74). Discusión de resultados Entre los factores que pueden incidir en la ausencia de la bacteria están las diferentes metodologías para la detección y el aislamiento de E. coli O157:H7. Sin embargo, es difícil comparar el resultado obtenido en diferentes partes del mundo debido a la variedad de los procedimientos utilizados. El porcentaje de detección aumenta cuando se utiliza la metodología de separación inmunomagnética, aún cuando esto depende del tipo de muestra y la presencia de la bacteria.
En los últimos años se ha evidenciado que E. coli O157:H7 está presente en los establos; pero no es fácil su aislamiento a partir de leche y productos lácteos, y la mayoría de los trabajos han reportado una incidencia nula o muy baja. En el trabajo de Roldan et al. (27) no fue posible aislar E. coli O157:H7 a partir de la leche de tanques colectores de leche (tanques para colección y enfriamiento) en Argentina. Discusión de resultados
Otro caso asociado es el de Connecticut en el 2008 en el que de 7 casos confirmados 6 presentaban la E. coli O157:NM que producía verotoxinas, en este caso el establo indicado como fuente de contaminación cumplía con la reglamentación del estado respecto a la comercialización de la leche, pero presentaba algunas deficiencias en el manipuleo del producto.
El cumplimiento de la reglamentación sobre la obtención y comercialización de la leche cruda en los establos de ciertos estados en E.E.U.U mediante prácticas de higiene estándar (lavado cuidadoso de las manos, sanitización de los equipos) pueden reducir pero no eliminar el riesgo de la contaminación de la leche, a su vez la recolección de la leche cruda usando estrictos controles de higiene puede hacer que esta no sea considerado necesariamente libre de patógenos (71). Discusión de resultados En otro estudio de Massa et al (73) se investigó la presencia de la E. coli O157:H7 verotoxigénica en 100 muestras de leche de establo de la provincia de Puglia y Basilicata en Italia en 1997 no se encontró la presencia de la bacteria en ninguna de las muestras, argumentando que era muy poco común su aislamiento en leche.
Entre los factores que apoyan la hipótesis de la presencia de E. coli O157:H7 en leche cruda se encuentran el asociado a que las vacas serían un vector natural de la bacteria encontrándose ésta en sus intestinos y diseminándose a través de las heces al medio ambiente (48,49).
Otro de los factores son las malas condiciones del establo donde se procesa el producto (ordeño, almacenamiento, distribución) según los casos reportados en los Estados Unidos como el de Oregón 2005 en el que 18 personas de 140 presentaron síntomas de enfermedad luego de consumir la leche contaminada con la bacteria. Las condiciones de los ambientes no eran las óptimas ya que a su vez no cumplía con las reglamentaciones locales para la obtención y comercialización de leche cruda en ese estado. Discusión de resultados El estudio de E. coli O157:H7 productora de verotoxinas en leche de establos se estableció por referencias de otros autores de la presencia de la bacteria en el Perú. Según los resultados de Blanco et al (6) se encontró una prevalencia de 8,1% para la cepa de E. coli O157:H7 productora de verotoxinas en 33 de 407 muestras de alimentos (carne de vaca, queso blando y verduras) en 42 distritos de Lima entre Octubre del 2000 y Febrero del 2001. Además Huapaya et al (63) que reportó un aislamiento de E. coli O157:H7 en una muestra de heces de un lactante de 11 meses de edad con un cuadro de diarrea disentérica.

En América Latina se encuentra el estudio de Reuben et al (72) de Costa Rica, en el que se aisló cepas de E. coli O157:H7 en 2 de 150 muestras de leche cruda de establos de la región metropolitana de San José en el 2002 siendo este el primer reporte de la bacteria en la región de Centroamérica, empleando el aislamiento en agar selectivo, medios bioquímicos y la identificación serológica con el método de aglutinación en látex, lo que indica que él método seguido en él presente trabajo resultaría también válido. Discusión de resultados Los resultados hallados indican que las cepas encontradas pertenecen a la especie E. coli no siendo del serotipo O157 y no conteniendo ninguna de las Verotoxinas según el método aplicado.
La presencia de otros serotipos distintos a la O157 no se descarta ya que se aplica el mismo método para su aislamiento (11) siendo la diferencia en la utilización de los reactivos específicos para los serotipos distintos a O157:H7 o en la aplicación de otras técnicas.
En relación a la ausencia de las toxinas Stx1 y Stx2 según el método aplicado, indica que el potencial toxigénico de las cepas halladas es poco probable, considerado por la relación entre presencia de Verotoxinas y SUH principalmente. Discusión de resultados Frecuencia de condiciones higiénicas del total de las muestras Condiciones de higiene:
Buenas: Se considera para la presente tesis condiciones de higiene buenas:
Infraestructura física adecuada para realizar cada una de las actividades de un establo como muros perimétricos, zona de ordeño delimitada, zona de alimentación, zona de descanso del ganado, colección de la leche (tambos de colección).
Procedimientos estándares de trabajo.
Personal operativo con indumentaria adecuada.
Disposición de las vacas en lugares apartados del contacto de otros animales extraños.
Acceso restringido al contacto con los animales a personas externas (compradores, visitantes, etc.).

Malas: considera para la presente tesis condiciones de higiene malas:
Infraestructura física inexistente.
Falta de procedimientos estándares de trabajo.
Personal operativo sin indumentaria adecuada.
Hacinamiento de los animales del establo y contacto con otros animales (perros, gatos, aves de corral, etc.).
Contacto con los animales a personas externas (compradores, visitantes, etc.).
Distribución de la leche en envases inapropiados y de dudosa procedencia. Frecuencia de condiciones higiénicas del total de las muestras Frecuencia de tipo de ordeño del total de las muestras Frecuencia de toma de muestra del total por distrito de Lima Metropolitana Frecuencia de toma de muestra del total por distrito de Lima Metropolitana Metodología

Recolección
Determinación de Coliformes y E. coli
_ Dilución e incorporación.
Método de test rápido Petrifilm®
Determinación de E. coli O157:H7
_ Enriquecimiento
Caldo TSB modificado con Cefixima y Vancomicina.
_ Aislamiento de E. coli O157:H7
Agar SMAC-TC
Agar TSAYE
_ Screening presuntivo
IMViC
Agar MUG
_ Confirmación
Sistema Api® 20E
Kit Oxoid ® O157
Test rápido Duopath® Verotoxin E. Coli Entero hemorrágica en leche Mecanismo de acción de la bacteria El Síndrome Urémico Hemolítico es un desorden multisistémico caracterizado por presentar insuficiencia renal aguda (IRA), anemia Hemolítica Microangiopática y Trombocitopenia grave, con microangiopatía de selectiva localización renal, manifestaciones de lesión isquémica en otros órganos como sistema nervioso central, retina, miocardio, páncreas e intestino
La base patogénica del SUH está determinada por el daño de las células endoteliales de los pequeños vasos del colon, riñón y sistema nervioso central. Como esos tejidos no forman parte del epitelio intestinal donde coloniza Escherichia coli productor de verotoxina (STEC) se postula que, el daño endotelial es una consecuencia directa de la acción de Stx que, liberada por las bacterias atraviesa la barrera intestinal y ganan acceso a la circulación sanguínea. Los genes de esta toxina se encuentran codificados en fagos que infectan las bacterias Escherichia coli Síndrome Urémico Hemolítico Mecanismo de acción de la bacteria Identificar la presencia de toxinas de E. coli O157:H7 en leche cruda, de establos de Lima Metropolitana.

Objetivos específicos
_ Identificar la presencia de coliformes en leche cruda, de establos de Lima Metropolitana.
_ Identificar la presencia de E. coli en leche cruda, de establos de Lima Metropolitana.
_ Identificar la presencia de E. coli O157:H7 en leche cruda.
_ Identificar la producción de toxinas de E. coli O157:H7. Objetivos


UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
 
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
 
E.A.P. FARMACIA Y BIOQUÍMICA
 
“Aislamiento, caracterización y detección de toxinas de Escherichia coli O157:H7 a partir de leche fresca de vaca de establos de Lima Metropolitana durante los meses de enero, febrero y marzo del 2009”
 
Tesis para optar al título profesional de Químico Farmacéutico
 
Bachiller Víctor Erick Estacio Malpartida
Bachiller Edwin Alonso Aguirre Ramos
 
Asesor:
Q.F. Victoria Yrei Yamakawa
 
 
Lima – Perú
2012 En las muestras de leche cruda de establos de Lima metropolitana se encontró coliformes en un 88% de las muestra con una cantidad que está entre 1000 y 28 x106 ufc/mL, lo que se encuentran fuera del límite permitido según los “Criterios Microbiológicos de Calidad Sanitaria e Inocuidad para los Alimentos y Bebidas de Consumo Humano” que señala como máximo permitido hasta 1000 ufc/mL.
Se encontró E. coli en un 66% de las muestra con una cantidad entre 5000 y 1,4 x106 ufc/mL,
No se encontró presencia de la E. coli O157:H7.
No se encontró presencia de verotoxinas producidas por la E. coli O157:H7. CONCLUSIONES La evidencia que se encuentra en otros trabajos realizados es la baja proporción de aislamiento de E. coli O157:H7 a partir de leche almacenada en tanques colectores, cuando se compara con la alta prevalencia de este patógeno en los establecimientos de ordeño. Esto puede explicarse por la baja prevalencia de E. coli O157:H7 en las vacas de establos lecheros, a pesar de que la prevalencia en las áreas de ordeño puede ser alta, y por el gran factor de dilución que representa el mezclado en el tanque de almacenamiento de la leche proveniente de todas las vacas del tambo, durante uno o más ordeños.
Por otra parte, algunos componentes de la leche tienen un efecto inhibitorio sobre las bacterias contaminantes, en especial el sistema lactoperoxidasa, que si bien actúa preferentemente sobre bacterias gram positivas, tiene poder bactericida sobre las gram negativas, incluyendo a E. coli. Estudios con leche contaminada artificialmente han demostrado que el agregado de los componentes del sistema lactoperoxidasa produce la inhibición o inactivación de E. coli O157. Discusión de resultados Frecuencia de tipo de Conservación del total de las muestras Resultados Mecanismo de acción de la bacteria
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