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Plaquetas e Hemostasia

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by

Tchello Silveira

on 19 December 2014

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Transcript of Plaquetas e Hemostasia


SÉRIE PLAQUETÁRIA E HEMOSTASIA
Universidade FEEVALE / Pós Hematologia- Hemoterapia

Maristela B. Biermann

Mulher, 35 anos, foi encaminhada ao hematologista por apresentar TTP aumentado (TTP= 64 segundos; CN= 28 segundos). O TTP foi repetido quando do encaminhamento e manteve o mesmo resultado. Nega historias de sangramento.
Que interpretação deve ser feita do resultado?
Coagulação
Discussão dos casos
Mulher, 35 anos, deu entrada na emergência de um hospital por infarto do miocárdio.
Terapia anticoagulante foi instalada, mas antes do inicio da terapia vários testes de coagulação foram realizados e os mesmos foram repetidos 4 horas após o início da terapia.
Resultados (antes do início da terapia) :
TP=12,2 segundos (CN=13 segundos)
TTP=28 segundos (CN=28 segundos)
Fibrinogênio=300mg/dl (VR=150 a 450mg/dl)
Produtos de degradação de do fibrinogênio/fibrina (PDF)= negativo
Pesquisa de D-dímero= negativa.
Resultados ( após 4 horas do início da terapia)
TP=17,2 segundos (CN=13 segundos)
TTP=55 segundos (CN=28 segundos)
Fibrinogênio=32mg/dl (VR=150 a 450mg/dl)
Produtos de degradação de do fibrinogênio/fibrina (PDF)= acima de 160,0 µg/ml
Pesquisa de D-dímero= 300ng/ml.
Que interpretação deve ser dada aos resultados?

Criança de 9 anos realizou exames pré-operatórios à extração dentária.
Os resultados foram:
TTP = 58 segundos (CN= 28 segundos)
TP= 11 segundos (CN= 11 segundos)
TS= 6,5 Minutos (VR= 2 a 7 minutos) e contagem de plaquetas= 234.000/microlitro.
Há 2 anos foi submetida à apendicectomia e não apresentou complicações hemorrágicas. Pelo lado paterno não apresenta história de doença hemorrágica, não há informações do lado materno.
A criança apresenta algum defeito nas hemostasias primária ou secundária ?
A extração dentária pode ser realizada?
Homem, 64 anos, antes de ser submetido à cirurgia coronariana, realizou exames pré-operatórios. Os resultados foram:
TTP = 76 segundos (CN= 30 segundos)
TP= 17 segundos (CN= 13 segundos)
O paciente tem história positiva para coagulopatias e já foi submetido anteriormente a outras cirurgias sem apresentar episódios hemorrágicos. Os exames foram repetidos e confirmados, inclusive com recoleta. O corpo clinico do hospital não aceita os resultados.
Qual atitude deve ser tomada pelo laboratório?

Diagnóstico Laboratorial das Trombofilias Adquiridas
Síndrome Antifosfolipídeo (SAF)

Mais comum
Associada tanto à trombose arterial como venosa
Técnicas de dosagem de inibidor:

Quantificação de inibidor em hemofilia:

Método Bethesda ( Kasper e cols. Em 1975)

Método Nijmegen ( Bethesda modificado, VERBRUGGEN et al.,1995)  é o mais recomendado pela Federação Mundial de Hemofilia pois as modificações diminuem o falso positivo e reduzem o CV do teste  teste mais confiável.


Diagnóstico Laboratorial dos inibidores:

Testes realizados após pelo menos 3 dias da última infusão de concentrado;
Se constatado presença de inibidor, fazer segunda dosagem 3-4 semanas da primeira;
Titulações mensais do inibidor ou a cada 3 meses para determinar se o paciente desenvolveu inibidor de baixa ou alta resposta.

Doença de von Willebrand
Testes Laboratoriais

1. Testes de Triagem:
TS, Contagem de plaquetas e TTPA
2. Testes Confirmatórios:
Fator VIII-C
Determinação do FVW antígeno (FVW:Ag) - ELISA
Determinação da atividade do FVW (FVW:RCo) – Aglutinação de plaquetas
Ligação do FVW ao Colágeno (FVW:CB)
Testes Especiais:
Agregação plaquetária induzida pela ristocetina (RIPA)
Capacidade de ligação ao FVIII (FVW:FVIIIB)
Análise multimérica do FVW
Diagnóstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditárias
Doença de von Willebrand
Proteína de adesão presente no plasma, subendotélio e grânulos  das plaquetas.
Funções:
Se ligar as estruturas expostas do subendotélio e às plaquetas, iniciando a hemostasia primária;
Ligação entre as plaquetas;
Transporta o F VIII na circulação e livre é inativado (hemostasia secundária).

Interpretação de testes de triagem
______________________________________________________________
TTPA anormal isoladamente
Associado com sangramento: deficiência dos fatores VIII, IX e XI.
Não associado com sangramento: deficiência de fator XII, pré-calicreína,
cininogênio de alto peso molecular e anticorpo lúpico.
TP anormal isoladamente
Deficiência de fator VII
TP e TTPA anormais
Anticoagulantes, coagulação intravascular disseminada, deficiência de vitamina K, transfusão maciça
Afibrinogenemias, deficiências de fatores X, V e II.

Testes de Triagem

Tempo de Trombina
Testa a conversão do fibrinogênio em fibrina;
Prolongado na presença de heparina, disfibrinogenemias, hipofibrinogenemia;
Incoagulável na afibrinogenemia;
O tempo normal do reagente selecionado deve ter tempo normal cerca de 20 seg. para ter sensibilidade suficiente pra detectar anormalidades leves do Fibrinogênio;
Utilizado para detecção de heparina não-fracionada contaminante de amostras colhidas de cateter de longa permanência, mantidos com heparina ( TT e TTPA prolongado).
Protocolo de Infusão Intravenosa de Heparina em Pacientes Não Neurológicos

HIAE – Normograma de Raschke modificado
Alvo terapêutico TTPa = 60 a 90 seg.;
Bolus inicial seguido com infusão corrigida conforme o valor do TTPa;
TPPa, RNI e Hemograma antes de iniciar tratamento;
Bolus inicial de 80 unidades/Kg ;
18 U/K g /hora;
Dosar TTPa 6h após inicio e repetido a cada 6h;
Quando ocorrer 2 controles seguidos dentro da faixa ideal, fazer controle a cada 12h;
Novos anticoagulantes orais:



São necessários estudos multicêntricos definitivos,
para sedimentar o uso e a segurança destes novos agentes anticoagulantes na prática clínica.
Novos anticoagulantes orais:

Estudos clínicos em Fase III com agentes que inibem seletivamente o fator Xa e a Trombina:

Dabigatran – inibidor direto oral da trombina
Rivaroxaban e Apixaban – inibidores diretos orais do fator X

Não são neutralizados pelo FPT4, evitando HIT
Tempo de Protrombina

Resistência à anticoagulação oral: ausência ou irregularidade no prolongamento do TP/INR. No caso de resistência verdadeira deve ser solicitado:

Sensibilidade Genética a Warfarina Padrão (detecta os genes; CYP2C9*1, CYP2C9*2 e CYP2C9*3) onde a dose pode aumentar em até 20 vezes para alcançar o efeito;


Interpretação dos resultados Agregometria por Impedância:

O teste é apropriado para o acompanhamento de pacientes sob o tratamento de antagonistas ou inibidores de receptores plaquetários.
Teste de Agregação Plaquetária por sistema de impedância:

Técnica
Sempre em temperatura ambiente
Em cubeta de reação diluir sg total 1:2 com salina;
Totalizar volume de 1 mL ;
Adicionar o eletrodo na cubeta;
Adicionar agentes agonistas;
Agregação é medida por impedância;
Plaquetas se agregam, ocorre um aumento da resistência elétrica em um eletrodo de platina colocado no sangue total;
O aumento é proporcional à função plaquetária

Teste de Agregação Plaquetária por sistema óptico: Padrão ouro

Avaliação pela variação da densidade óptica de um plasma rico em plaquetas sob ação de um agregante (adrenalina, ADP, ristocetina e colágeno).
Ocorre então a formação crescente de grandes agregados plaquetários, acompanhados pela diminuição da turbidez da amostra. A mudança da densidade óptica é transmitida pelo agregômetro, em porcentagem de agregação.

Adesividade plaquetária:
Avalia a função plaquetária de adesividade na doença de Vw, Tromblastemia de Glanzman e Síndrome de Bernard-Soulier

A adesividade in vivo pode ser estimada comparando-se a contagem de plaquetas no sangue anticoagulado com a mesma contagem no sangue obtido por punção digital com pipeta de Sahli.
O resultado expressará o percentual de plaquetas aderidas ao vidro.

MÉTODO: In vivo, baseado no teste de Borchgrevink
Técnica da RC:

Após o término do TC, deixar os tubos em b.m á 37ºC;
Deixar em banho-maria por 2 horas;
Verificar se houve ou não a retração do coágulo;
O resultado pode ser expresso como coágulo retrátil, parcialmente retrátil ou irretrátil;
VR é coágulo retrátil;
Sem significado clínico

* Também pode –se dar o valor da retração do coágulo: se for aspirado 0,4 mL de soro,
então o resultado da RC é 40%
A tecnologia de Citometria de Fluxo Fluorescente também é utilizada para analisar de forma eficiente e reprodutível a contagem de plaquetas fluorescentes no Sysmex XE-2100™; ajuda na contagem das plaquetas imaturas.

Além disso, a análise das plaquetas fluorescentes (PLT-O) permite uma contagem mais precisa das plaquetas quando o método de impedância apresenta interferências.
O endotélio auxilia a inativação dos fatores da coagulação pela Antitrombina e pelo TFPI; O endotélio favorece a fibrinólise pela secreção do ativador do plasminogênio – tPA, que cliva o plasminogênio em plasmina na superfície do coágulo. A plasmina digere a fibrina liberando na circulação o fragmento D-Dimero;
Para prevenir a coagulação inapropriada, o fluxo sanguíneo dispersa os fatores ativados que se soltam das superfícies celulares, ao mesmo tempo que possibilita a chegada de anticoagulantes naturais e das proteínas pró-fibrinolíticas.

Antitrombina
TFPI (inibidor da via do fator tissular)
Proteína C
Proteína S
Propagação: combinação das proteases ativas com seus cofatores e formação de complexos “tenase” e “protrombinase” na superfície da plaqueta, fisiologicamente o local melhor adaptado para a geração de quantidades hemostáticas de trombina.

A Trombina cliva o fibrinogênio em monômeros de fibrina e ativa o fator XIII, dando firmeza ao coágulo.


Hoffman e colaboradores, década de 90:

Iniciaram a explicar o que seria chamado de Modelo Celular da Coagulação , regulada pelas propriedades das superfícies celulares através da expressão de receptores para as proteínas da coagulação.

Não há ativação em cascata dos fatores e sim uma sobreposição de 3 estágios.
MacFariane e Ratnoff, há 40 anos:
Cascata da coagulação tradicional
as proteínas da coagulação teriam papel chave no controle da hemostasia, com ativação em cadeia, servindo primariamente como fonte de fosfatidilserina;
Conhecido como “modelo proteinocêntrico”.
Lesão endotélio

A Hemostasia pode ser dividida em duas partes:
Hemostasia primária: participação dos vasos, plaquetas
e céls. endoteliais;
Hemostasia secundária: participam da hemostasia secundária as plaquetas, céls. endoteliais, fatores, inibidores fisiológicos,
sistema fibrinolítico e mecanismos antifibrinolíticos.


O sangue dentro dos vasos deve permanecer líquido.
Mas quando há uma lesão, o sangue deve se tornar sólido; deve haver a formação do coágulo de fibrina, formando um tampão hemostático para parar a perda hemorrágica. Deve haver uma reparação tecidual e depois o tampão deve ser removido para restabelecer o fluxo sanguíneo.

Diagnóstico Laboratorial das Trombofilias Adquiridas

Síndrome Antifosfolipídeo (SAF)
Trombofilias Hereditárias:
Mutação da protrombina G20210A
Mutação do fator V de Leiden
Mutação da Metilenotetrahidrofolatoredutase (MTHFR)
Homocisteína
Antitrombina
Proteína C
Proteína S livre



Trombofilias

Estado de hipercoagulabilidade, herdado ou adquirido, que predispõe a um risco aumentado de trombose é denominado TROMBOFILIA.

Trombofilias hereditárias
Trombofilias adquiridas

Diagnóstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditárias

Coagulopatias raras
Método funcional, técnica em uma etapa
Deficiência de fator VII Deficiência de fator V
Deficiência de fator X Deficiência de fator XI
Deficiência de fator XII
Método do princípio da solubilidade em sol. de uréia 5M
Deficiência de fator XIII
Método de Clauss
Deficiência de fibrinogênio (fator I)
TP e Dosagem imunológica da protrombina
Deficiência de fator II (protrombina)

Técnicas de dosagem de inibidor:
Detecção do inibidor pelo Teste de mistura:
Exemplo do cálculo de correção pela mistura com pool de plasma normal.
HEMOFILIA A e B Diagnóstico Laboratorial

TTPA (triagem)
Determinação da atividade coagulante dos fatores VIII e IX: determinação de FVIII: C e/ou FIX: C

Permite a classificação da gravidade
Método cromogênico para FVIII: melhor reprodutibilidade
no limite inferior da curva, porém o Coagulométrico é mais utilizado.

Pesquisa e quantificação de inibidor

Diagnóstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditárias
HEMOFILIA

A hemofilia é uma doença hemorrágica hereditária caracterizada pela deficiência dos fatores VIII
(hemofilia A) ou IX (hemofilia B).
Da totalidade dos casos, as hemofilias A e B compõem 70%-85% e 15%-30% dos casos, respectivamente.
De acordo com os níveis circulantes dos fatores VIII ou IX, se <1%, 1-5% ou >5 a >40%, a hemofilia é classificada como grave, moderada ou leve, respectivamente.

Em muitos centros o TS foi substituído pelo teste de análise da função plaquetária através do emprego do analisador de função plaquetária, equipamento que simula, in vitro,
a alta força de cisalhamento do vaso para proporcionar um ambiente hemodinâmico real, de forma a medir a função plaquetária. Maior sensibilidade.
Tecnologia PFA-100
Classificação e caracterização laboratorial da doença de von Willebrand
Diagnóstico Laboratorial das Coagulopatias Hereditárias

Doenças hemorrágicas resultantes da deficiência quantitativa ou qualitativa de uma ou mais fatores da coagulação.

Redução da formação de trombina
As hemofilias e a doença de Von Willebrand (DVW) são as mais comuns

Materiais e Reagentes:
Tubos de vidro 12 x 75 mm
Solução fisiológica
Trombina 4 U/ml (humana ou bovina)
Micropipetas automáticas (100 μl e 200 μl)
Cronômetro
Banho-maria a 37º C
Técnica
200 μl do plasma teste
Incubar a 37º C por 60 segundos
Adicionar 100 μl da trombina
Cronometrar o tempo de coagulação
As provas deverão ser realizadas em duplicata


Protocolo de uso de Heparina em Pacientes Pediátricos:
(<18 anos)

Sempre que possível utilizar HBPM;
Dosar TTPA, TP, FIB, D-DIMEROS e Hemograma inicial;
Manter PLT >60.000 a 100.000;
Dose de ataque de acordo com a clinica;
Acesso exclusivo para a infusão;
Não colher controle da mesma linha de infusão;
Usar o valor da relação para o controle (1,5 a 2,5); ou em seg. a critério médico
Monitoraa a HBPM pelo Anti-Xa depois da 2º ou 3 dose.




Protocolo de Infusão Intravenosa de Heparina em Pacientes Neurológicos

TPPa, RNI e Hemograma antes de iniciar tratamento; hemograma a cada 3 dias;
Como regra não se adm Bolus inicial;
Sol. Padrão 50 U de heparina /mL ;
Infusão inicial conforme peso;
Dosar TTPa 6h após inicio e repetido a cada 6h;




No caso de controle de heparinoterapia não fracionada (HNF), é importante realizar o teste o mais rápido possível (em até 1 hora) após a coleta, para evitar a neutralização da heparina pelo fator plaquetário 4 (FPT4) .

Materiais e Reagentes:
Tubos de vidro 12 x 75 mm
Micropipeta automática (100 μl)
Cefalina contendo um ativador (sílica, caolim, ácido elágico, etc)
Cloreto de cálcio 0,025 M
Cronômetro
Banho-maria a 37ºC
Procedimento
100 μl do plasma teste 100 μl de cefalina ativada
Incubar a mistura a 37ºC por 3 minutos
100 μl de cloreto de cálcio 0,025 M pré-aquecida a 37º C
Cronometrar o tempo de coagulação
As provas deverão ser realizadas em duplicata
Testes de Triagem

Tempo de Tromboplastina Parcial ativada

TTPA avalia a def. dos fatores da via intrínseca e comum;
É mais sensível a defic. de F VIII, IX, XI, XII;
Reagente pode ser mais sensível à defic. de FVIII e IX;
Triagem para defic. de Fator, presença de inibidor ou para monitorar o uso de heparina não fracionada;
Mistura do plasma do paciente + fosfolipídeo (substituto das plaq.) é recalcificada. Cefalina ativador da via;
A sensibilidade do TTPA é reagente-dependente.
Novos anticoagulantes orais, Inibidores direto da Trombina:

Monitorização do INR é pouco sensível e não recomendado.

Os testes mais sensíveis são:
TT
Tempo de coagulação do Ecarin(ECT)
Teste do inibidor da trombina (Hemoclot)
Em casos de Emergência poderá ser:
TTPA
TT
Novos anticoagulantes orais:

Warfarina – padrão anticoagulante oral
Janela terapêutica estreita
Metabolismo variável dependendo do Citocromo P450
Interação com fármacos e alimentos
Risco potencial de eventos hemorrágicos

Atualmente - novas moléculas não peptidicas, inibidoras de trombina e fator Xa com larga janela terapêutica, rápida ação

Exame:

DNA para tipagem dos alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 do citocromo P450 CYP2C9 usando a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Sensibilidade e especificidade são de 100%
Sg periférico em EDTA ou esfregaço de células bucais em etanol
Sensibilidade Genética à Warfarina Expandida - Sinonímia: Citocromo P450 2C9 e mutação VKORC1
(detecta os genes; CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*5, CYP2C9*6 e a mutação VKORC1) que podem reduzir as necessidades de warfarina do paciente  (1,5 mg ou menos, por dia) ; hemorragia c/ doses convencionais.

A warfarina é metabolizada pelo Citocromo CYP2C9.
No caso de:

a- INR > 20,0 na ausência de sangramento,
b- presença de sangramento com INR < 20,0,
c- necessidade de cirurgia imediata (tratamento hospitalar)

suspender o anticoagulante;
vitamina K 10 mg EV.;
Complexo protrombínico ou Fator VIIa ou plasma fresco à 10 a 20 ml/kg;
INR a cada 6 h.;
Repetir a dose de vit. K se necessário, após 12 h.

Sangramento grave, ameaçando a vida do paciente
concentrado de fatores recombinantes como Complexo protrombínico e Fator VII ativado

INR entre 4,0 e 6,0
suspender o anticoagulante;
repetir o INR a cada 24 h.

INR entre 6,0 e 10,0
vitamina K : 0,5 a 1,0 mg VO ou SC.;
repetir a dose se INR > 6,0 após 24 h.

INR entre 10,0 e 20,0 (UPA ou hospitalar)
vitamina K de 3 a 5 mg EV.;
INR a cada 6h;
repetir a dose de vitamina K se INR > 10,0 após 12 h.s
Relação Normalizada Internacional

RNI = [TP do paciente/TP normal (média do valor de referência)] ISI

ISI= Índice de Sensibilidade Internacional

PÂNICO:
INR > 4,0 (AP < 10%)
Coleta e preparação do POOL (PPN)
-sangue de 20 a 40 pessoas sadias
-não tenham usado medicação nos últimos 10 dias
-Número semelhante de homens e mulheres com idade entre 20 e 50 anos
-todo o procedimento não deve exceder 4h
Centrifugação a 3000 rpm por 15 minutos (PPP);
Observar a presença de hemólise e lipemia (descartar); dosar sem demora o TP e TTP duplicata (VR);
Utilizar pipeta calibrada e tubo plástico;
Alíquotar e congelar. Validade 6 meses (- 80º C) e 3 meses (-35º C).

Curva de calibração para tempo de protrombina
Utilizar plasma calibrador de conc. conhecida e tampão
Tempo de Protrombina

TP avalia as via extrínseca e comum da coagulação. É dependente da integridade dos fatores VII, V, II, e X;
Fator tecidual F VIIativa a via extrínseca;
TP aumentado pode indicar defic. Hereditária ou adquirida (defic. Vit.K, doença hepática, CIVD, uso de medicamentos);
É mais sensível à deficiência de FVII e menor sensibilidade aos fatores da via comum e ao fibrinogênio;
RNI: instituída pela OMS para padronizar as diferenças de resultados de TP (para pacientes em uso de anticoag. oral).

Exemplo:

PRP = 800.000 plaquetas/mm3 para chegar a 300.000 plaquetas/mm3
800.000 ÷ 300.000 = 2.6
Portanto, o PRP deverá ser diluído 2.6 vezes
1 volume de PRP + 1.6 volumes de PPP
Se o volume obtido do PRP for 4 ml
1 ml de PRP ----------------------------- 1.6 ml de PPP
4 ml de PRP ------------------------------ X ml de PPP
X = 6.4 ml
Portanto, a adição de 6.4 ml de PPP a 4 ml de PRP reajustará o número de plaquetas para 300.000/mm3

Transporte: TA
Processamento: não deve exceder 3 a 4 horas
PRP: centrifugação dos tubos com tampa (pH entre 7.7 – 8.0) a 200 x g por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente
Correção: PLT acima de 600.000 deve-se reajustar para 300.000/mm3
Tempo:
a agregação plaquetária por sistema óptico deve ser realizada entre 15 a 30 minutos após a preparação do PRP e finalizada dentro de 2 a 3 horas.

Cuidados na Fase pré-analítica do teste:

Coleta: sem trauma para evitar lesão no tecido com liberação de fator tecidual e ativação plaquetária;
Tubos: plástico ou vidro siliconizado para evitar adesão e ativação das plaquetas; à vácuo não ativa as PLT, pode ser usado;
Anticoagulante: citrato de sódio 3.2% (9:1);HCT acima de 55% fazer a correção
Técnica de Yvy:

Deve ser feito com muito rigor técnico para uma boa interpretação clínica.
Aplicar uma pressão de 40mmHg com esfigmomanômetro e manter durante o teste;
Fazer a incisão na região logo abaixo da dobra do cotovelo, sem veia visível;
Fazer assepsia no local e com uma lanceta de 1 mm de profundidade para adulto (crianças 0,5mm), fazer 3 incisões(1cm de distância);
Acionar o cronômetro e, a cada 30 seg., com um papel filtro absorver o sangue que está fluindo;
Quando o sangramento cessar, tem-se o valor do TS;
Controlar no máximo até 15 minutos;
VR : 1 a 7 minutos
Na avaliação numérica das plaquetas obtidas por automação o CV é de 2%, enquanto no contagem manual é de 22%.
XE-5000™

Fração de Plaquetas Imaturas – (IFP%)

Usado para avaliar a trombocitopoiese;
Precisão e sensibilidade na contagem de plaquetas imaturas;
Delineamento de populações de plaquetas anormais encontradas pelo médico em quadros como
PTA (púrpura trombocitopênica autoimune) ou
PTT (púrpura trombocitopênica trombótica).
Cálculo:

Plaquetas por uL de sangue = (P/1000hm) x (hm/ uL) 1000

P= Quantidade de plaquetas
Hm= Quantidade de hemácias
Testes laboratoriais para a quantificação das plaquetas e caracterização de plaquetopenias hereditárias
Quantitativa: Trombocitopenia

Qualitativas: Alterações de Função
Processar e interpretar corretamente os exames
laboratoriais utilizados na avaliação da hemostasia.
Seleção e Qualificação de um Sistema Analítico:

Princípio do teste
Reagentes, estabilidade
Amostra
Desempenho analítico (exatidão, precisão,sensibilidade, especificidade, análise dos potenciais interferentes)
Intervalo de referência do método
Protocolo para a realização do teste
Recursos humanos ( grau de habilidade exigido)
Fornecedor (suporte técnico e científico, fornecimento regular dos reagentes )
Custo

Os testes usuais de triagem e de diagnóstico continuam dispondo de métodos manuais: detecção visual do coágulo de fibrina.

Nos anos 70 foram introduzidos os equipamentos semi-automatizados: detecção fotométrica ou mecânica.

Hoje equipamentos totalmente automatizados e interfaceáveis.
Avaliação Laboratorial da Hemostasia
Recomendações da SBPC / ML para Coleta de Sangue Venoso, 1ª.ed.,2005

Coleta de amostra para coagulação e suas variações pré-analíticas:

Jejum mínimo de 4 horas;
Coleta rápida sempre em tubos de vidro siliconizados;
Coleta não traumática e com tempo de garroteamento não superior a 1 minuto;
Coleta com seringa e/ou coleta à vácuo; quando realizada com seringa retirar a agulha para transferir o sangue ao tubo com anticoagulante evitando assim a hemólise;
Resultados confiáveis em testes de hemostasia:

Influência da coleta
Influência do armazenamento do plasma
Influência do transporte da amostra
Influência da estabilidade da amostra
Influência dos procedimentos técnicos para realização do teste como centrifugação
Conhecimento de técnicas e métodos empregados em laboratório de hemostasia
Análise de qualidade e validação
Padronização dos processos: etapas pré-analítica, analítica e pós-analítica
A plasmina que se solta é rapidamente inativada
pela 2 anti-plasmina
(sintetizada no fígado com função anti-fibrinolítica);
Da mesma forma a tPA é inativado pela ação do PAI – Inibidor do ativador do plasminogênio, restringindo a dissolução do coágulo.
O endotélio sadio adjacente ao local de lesão restringe a extensão do coágulo. A trombomodulina se liga a trombina que muda a sua especificidade e passa a agir como anticoag. pela ativação da proteína C .
A proteína C ativada junto com seu cofator proteína S, inativa os fatores V e VIII dos complexos protrombinase e tenase, desarmando os principais complexos responsáveis pela geração de grandes quantidades de trombina.


Amplificação: ocorre com a mudança do processo de fibroblasto para a superfície plaquetária.
O estímulo é amplificado à medida que a plaqueta adere, se ativa e acumula cofatores ativados em sua superfície.
Trombina, é um potente ativador plaquetário. Esta ativação se reflete pela exposição da fosfatidilserina na mb da plaqueta;

A plaqueta através da ativação dos cofatores V e VII e subsequente ligação aos seus respectivos receptores, tem parcialmente montados os 2 complexos que irão dar origem a explosão da geração de trombina subsequente.

Iniciação: ocorre nas células capazes de expressar fator tecidual,
uma proteína integral de membrana presente nas células da matriz subendotelial (fibroblastos) e nos monócitos e células endoteliais em estados inflamatórios.
Fator tecidual – grande iniciador fisiológico da coagulação;
O fator exposto ao plasma pela lesão vascular, se liga ao fator VII, gera uma pequena quant. de trombina, a partir da ativação dos fatores X e V; Trombina – potente ativador plaquetário.

Novo modelo celular da Coagulação:
A coagulação ocorre em 3 etapas:

A iniciação
A amplificação
A propagação

A teoria clássica da coagulação foi descrita por
Paulo Morawitz em 1905:

Reuniu 4 "Fatores de coagulação" no seu esquema de coagulação;
Na presença de cálcio e de tromboplastina,
se acreditava que a protrombina era convertida em
trombina. Por sua vez, na presença de trombina,
fibrinogênio era convertido em fibrina, permitindo a formação de um coágulo de fibrina.

NOVOS CONCEITOS EM HEMOSTASIA:

O MODELO CELULAR DA COAGULAÇÃO


O conjunto desses mecanismos é denominado hemostasia.
Os componentes do sistema hemostático são as plaquetas,
os vasos, as proteínas da coagulação,
os anticoagulantes naturais e o sistema de fibrinólise.

Auto-controle Domiciliar – Monitor Portátil

Treinamento
Adequação da dose
Somente em dúvida procura o médico

Limitações:
- Capacidade de aprendizado
- Adesão ao tratamento
- Profissionais para apoio à distância

Drogas que interferem com a função plaquetária:
Teste de Agregação Plaquetária:
3- Retração do coágulo:

É a fase final do processo de coagulação.
Avaliação funcional das plaquetas.
Na deficiência funcional das plaquetas a retração se encontra diminuída mesmo com nº normal de plaquetas.
2- Tempo de sangramento:
Avalia a hemostasia primária. É um método sensível às alterações vasculares e principalmente às alterações quantitativas e qualitativas das plaquetas.

Deve ser feito com muito rigor técnico para uma boa interpretação clínica, mas é um bom exame para a avaliação funcional das plaquetas.

Não deve ser feito em vigência de Púrpura e por quem toma antiagregantes plaquetários.
XE-5000™
Medida das plaquetas por fluorescência óptica - (PLT-O)

Contagem por impedância e contagem das plaquetas por fluorescência óptica;
Dupla tecnologia para melhorar a precisão das contagens muito baixas e muito altas;
Parâmetro reportável;
RBCs e PLTs são contados em um canal dedicado usando o método de impedância e foco hidrodinâmico que minimiza os fenômenos de coincidência e recirculação. 
Analisador Hematológico - Sysmex XT-1800™

Embora o EDTA seja o anticoagulante de rotina mais utilizado para contagem de células sangüíneas, ele pode induzir alterações na forma e ultra-estrutura das plaquetas.

Plaquetas coletadas com EDTA, se alteram com o tempo e temperatura, se tornam esféricas e quando coletadas com Citrato tornam-se discóides - VPM aumenta 20% nas 2 primeiras horas quando coletado com EDTA.
Os mais modernos:
detecção imunológica por citometria de fluxo como auxílio de fluorocromos conjugados com o monoclonal CD61 (ICSH,2001)

VPM Alto: plaquetopenias por redução da sobrevida das PLT
VPM Baixo: plaquetopenias por deficiência de produção medular
PDW : anisocitose plaquetária

Estudo das plaquetas


* Método Automatizado
A maioria deles utiliza o método de impedância eletrônica ou sinal óptico.

As limitações são: discriminação de plaquetas com outras partículas de mesmo tamanho
1 - Contagem do número de plaquetas do sangue periférico
* Método Manual
Método de Fônio (Indireto)

Técnica
1 – Coletar o sangue com EDTA
2 – Fazer o esfregaço de sangue em lâmina e corá-la com o corante apropriado (o Método de May-Grunwald-Giemsa)
3 – Contar as plaquetas existentes em, no mínino 10 campos que contenham cerca de 200 eritrócitos por campo
4 – Contar o número absoluto de eritrócitos e relacionar com o número de plaquetas.
Estudo das plaquetas



Plaquetas realizam a função hemostática na hemostasia primária
a partir das funções de adesão e agregação. Correlacionam-se com os fatores de coagulação participando da hemostasia secundária. Em condições fisiológicas não estão ativadas. As patologias plaquetárias instalam-se por alterações numéricas ou funcionais.
Exames de Coagulação exigem tecnologia de ponta para realizar os mais diversos exames, com agilidade e precisão.
Coletas em condições especiais: via cateter de infusão com heparina:

Descartar 5,0 mL de sangue antes da coleta

1° tubo para soro

2° tubo com Citrato
(TP, FIB, ATIII, D-DIMERO)

3° tubo com Citrato para TT e TTP

Sempre considerar uma possível contaminação com heparina
Tubos:
Armazenamento e validade
Uso de anticoagulantes recomendados que preservam
melhor a qualidade das amostras (CLSI/NCCLS, ICSH):

* Citrato de Sódio tamponado a 0,109 mol/ L (3,2) proporção de 9: 1
Coagulação → prevenir aumento do pH
Cascata
Tradicional
Para determinação do inibidor do F IX
o tempo de incubação pode ser de
10 minutos pois não é
tempo-dependente.

Fonte: Hemofilia Congênita e Inibidor - Manual de Diagnóstico e Tratamento de Eventos Hemorrágicos, Ministério da Saúde, 2008.

Ex.1:houve correção imediata e incubada
Ex.2:correção só na imediata, sugere inibidor tempo-temperatura dependente
Ex.3:não houve correção, sugere inibidor de ação imediata

Técnicas de dosagem de inibidor:
Detecção do Inibidor pelo teste de pesquisa de inibidor:Plasmas são incubados separadamente 2h/37ºC
Serviço Especializado – Monitor Portátil - TLR

Tecnologia – CoaguChek XS
PLT Clumps?
Avaliar a morfologia plaquetária:
Confirmar trombocitopenia;
Avaliar tamanho (macroplaquetas, microplaquetas);
Tecnologia
Metodologia
Tecnologia

I
nterferência da Coleta

Com qual grau de hemólise devemos solicitar a nova colheita?


Hemólise




Liberação dos constituintes intracelulares para o plasma ou soro, quando ocorre a ruptura das células do sangue;
estes componentes podem interferir nos resultados das dosagens de alguns analitos.

Centrifugação da amostra

** Tubos de citrato devem ser centrifugados a uma velocidade e tempo para consistentemente produzir o plasma pobre em plaquetas (contagem de plaquetas < 10.000/mL) de acordo com normas do CLSI/NCCLS

Avaliação das condições das amostras: critérios de rejeição


RECOMENDAÇÕES DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA / MEDICINA LABORATORIAL PARA COLETA DE SANGUE VENOSO , 2ª Edição . 2010
- Homogeneização do tubo
Em presença de eritrócitos fragmentados ou plaquetas gigantes, a curva de distribuição de plaquetas é afetada.

As plaquetas obtidas por impedância não são confiáveis
Pelo resultado dos exames ela apresenta deficiência na hemostasia secundária, já que o tempo de sangramento e a contagem de plaqueta estão normais. Na Hemostasia secundária a deficiência é na via intrínseca porque o TP é normal. Quando o TTP está alterado, a deficiência está nos fatores de fase-contato ou nos fatores XII, XI, IX e VIII. Pelo fato de a paciente não ter episódios de sangramento, pode ser eliminada a possibilidade de hemofilia ( deficiência de fatores IX ou VIII). O fator deficiente pode ser cininogênio de alto peso molecular, pré-calicreína, fatores XII ou XI. Estes fatores foram dosados e a paciente tem deficiência de pré-calicreína, que não causa episódios hemorrágicos, mas altera o TTP. A diferenciação é importante porque o fator XI causa sangramentos em extrações dentárias. O defeito está na hemostasia secundária, via intrínseca e especificamente deficiência de pré-calicreína. A paciente pode ser submetida à extração dentaria.
Quando se tem o TTP e o TP alterados, a deficiência está nos fatores da via comum ou o paciente tem alteração de um fator da via intrínseca e outro da via intrínseca. Se for considerada a primeira situação o fator deficiente pode ser X, V, II, I ou XIII. A segunda possibilidade é de probabilidade praticamente nula. A deficiência de um fator da via comum cursa com sangramento e o paciente tem história negativa para coagulopatias. Frente a esta situação, a primeira atitude é verificar o valor do volume globular do paciente, no caso era de 72%. Os exames estão alterados pelo excesso de anticoagulante. Nova coleta foi realizada com a quantidade de anticoagulante corrigida e os resultados normalizaram
Neste caso não havia a influência do volume globular que sempre esteve dentro dos valores de referencia. O plasma da paciente deve ser misturado com um pool plasma normal e o TTP repetido. Se houver correção, a deficiência está nos fatores de coagulação; os fatores da via intrínseca devem ser dosados e deve-se da ênfase para a pesquisa da doença de Von Willebrand. Caso haja correção, o aumento pode ser devido à presença de anticoagulante lúpico.
A preocupação é saber qual terapia anticoagulante foi instalada.
É bastante interessante notar que antes do início da terapia anticoagulante foram requisitados exames de coagulação, situação que na maioria das vezes não ocorre e que, por não se saber o valor basal dos testes de coagulação, a intepretação posterior pode ficar comprometida. A terapia anticoagulante instituída foi heparina e estreptoquinase.
A primeira tem a finalidade de prevenir a formação de coágulos e a segunda a de lisar os coágulos formados. A queda de fibrinogênio, a presença de PDF e D-dímeros são consequência da ação da estreptoquinase.
Menina, 12 anos, apresenta frequentemente epistaxe e equimoses.
Micro hematúria é um achado consistente no parcial de urina. Aos 5 anos foi submetida à adenoidectomia e teve hemorragia grave. Traumatismo de joelho aos 7 anos resultou em hemartrose.
Foi solicitado coagulograma.
Resultado:
TTP= 68 segundos (CN= 28 segundos)
TP=10,5 segundos (CN=12 segundos)
TS= 17 minutos (VR= 3 a 9,5 minutos)
Plaquetas= 289.000/microlitro.
Qual a provável que a menina apresenta?
Como comprovar laboratorialmente a patologia?
A presença de hemartrose e hemorragia grave após a cirurgia falam a favor de hemofilia, o que compromete este pensamento são a presença de epistaxe e equimoses.
Os exames mostram uma deficiência na via intrínseca (TTP alterado com TP normal) e na hemostasia primária, mostrando que o defeito plaquetário é funcional (o numero de plaquetas é normal). Este quadro laboratorial fala a favor da doença de Von Willebrand. A comprovação laboratorial deve ser feita pela dosagem do fator VIII, dos multímetros de Von Willebrand e pela agregação plaquetária frente à ristocetina.
Mulher, 32 anos, foi admitida na UTI com diagnóstico de embolia pulmonar. Foram administrados de imediato 5.000 unidades de heparina de alto peso molecular via endovenosa. A equipe médica não aceitou o resultado.
Como o laboratório deve proceder frente à situação apresentada?
Deve ser eliminado o erro laboratorial ( troca de amostra ou resultado) e a quantidade de anticoagulante utilizada com relação ao volume globular. Foi descartado o erro laboratorial porque o volume globular estava dentro dos valores de referencia e a recoleta confirmou o resultado. A ação da heparina pode estar prejudicada em pacientes com baixos níveis de antitrombina, que é um co-fator da heparina. Níveis baixos de antitrombina são vistos na cirrose hepática, na síndrome nefrótica e na vigência de anticoncepcionais. A confirmação deve ser feita pela dosagem de antitrombina. Anti-histamínicos podem inibir a ação da heparina. A obesidade diminui a ação funcional da heparina. O que pode ser feito é utilizar heparina de baixo peso molecular; porque o mecanismo anticoagulante se dá por inibição do fator X ativado.
Homem, 27 anos, chega ao laboratório com requisição de hemograma e coagulograma. Ao ser interpelado sobre o motivo da realização dos exames, pela recepção, relata que toda vez que joga futebol fica com manchas roxas nas pernas. O hemograma e o coagulograma são normais, os exames realizados no coagulograma foram: TS, TC, FC, RC, TP, TTP e contagem de plaquetas. Após 10 dias da entrega dos resultados retorna ao laboratório com requisição médica solicitando a dosagem de todos os fatores de coagulação.
Tem fundamento a realização da dosagem dos fatores de coagulação?
O TP e o TTP são exames de triagem para hemostasia secundária, se eles estão normais é porque o paciente não é portador de coagulopatias. O tempo de sangramento e a contagem de plaquetas afastam a possibilidade de púrpura. O paciente não apresenta deficiência de nenhum fator e a realização da dosagem dos fatores de coagulação não tem fundamento.
Criança, 11 anos, chega ao laboratório com requisição de TS. A coleta percebe que a criança apresenta pontos vermelho-vivos e manchas avermelhadas em membro superior. O supervisor da coleta é chamado.
Que atitude deve ser tomada pelo supervisor ?
Manchas avermelhadas devem ser equimoses e ponto vermelho-vivos, petéquias. Estes achados são compatíveis com um quadro de púrpura e pode ser por deficiência plaquetária. O tempo de sangramento não deve ser realizado, porque conforme a deficiência plaquetária o sangramento (causado quando da realização do exame) pode não parar. O que pode ser feito é uma punção venosa para proceder a contagem e a visualização da morfologia plaquetária com posterior contato com o médico requisitante.
Está correta a solicitação de TC e TS como exames pré-operatórios?
O tempo de sangramento ainda avalia a hemostasia primária e, quando normal pode-se supor que o paciente não apresenta um quadro de púrpura. O tempo de coagulação é um exame ultrapassado por não ter valor clinico. A hemostasia primária fica parcialmente avaliada e a hemostasia secundária sem avaliação. A solicitação de apenas TS e TC não está correta
Foi solicitado o TP para controle da heparina de alto peso molecular.
O controle pelo TP é eficaz na heparinoterapia de alto peso molecular?
O TP pode ser utilizado para o controle da heparina de baixo peso molecular?
O TP não pode ser utilizado para o controle da heparina nem de baixo e nem de alto peso molecular. Na heparina de alto peso molecular, o TTP é o exame escolha porque se pode correlacionar a dose de heparina com o aumento de TTP. O TP não pode ser utilizado porque esta correlação não ocorre. A heparina de baixo peso molecular só pode ser controlada pela inibição do fator X ativado.
Criança, 4 anos, passou a apresentar hematomas e hemartrose. O médico solicitou coagulograma.
Resultado:
TP= 14 segundos (CN= 13 segundos)
TTP= 70 segundos (CN= 30 segundos)
TC= acima de de 25 minutos (VR= 6 a 12 minutos)
TS= 4 minutos (VR= 1 a 7 minutos)
Contagem de plaquetas normal.
Qual o provável diagnóstico laboratorial?
Que conduta laboratorial deve ser tomada?

Pelo aumento do TTP, a deficiência está nos fatores da via intrínseca da coagulação, a contagem de plaquetas e TS normais não falam a favor de doença de Von Willebrand. A presença de hematomas e hemartrose fala a favor de hemofilia. Deve-se fazer a dosagem de fatores VIII e IX. A diferenciação entre hemofilias A e B deve ser feita porque o tratamento é distinto.
Paciente realizando exames de rotina apresenta um hemograma com trombocitopenia importante e as demais séries (branca e vermelha) normais.
Que atitude deve ser tomada frente ao resultado do hemograma?
Como o hemograma foi realizado por aparelho de automação com diferencial em cinco partes o resultado pode ser liberado como sendo correto?
Trombocitopenia em hemograma sem nenhuma outra alteração deve ser pensado em agregação plaquetária induzida pelo anticoagulante, que na maioria das vezes ocorre frente ao EDTA. Esta situação pode ser corrigida realizando-se recoleta usando como anticoagulante a heparina ou o citrato de sódio. Imediatamente após a recoleta o sangue deve ser homogeneizado e a contagem de plaquetas procedida.
Tanto o paciente quanto o médico devem ser informados desta “sensibilidade in vitro ao EDTA”.
Homem, 35 anos, fez episódio espontâneo de TVP (trombose venosa profunda).
Foi internado e submetido à heparinoterapia. Após a alta, continuou sendo medicado com anticoagulante oral. Foi solicitada, após alta, pesquisa de proteína S, proteína C e antitrombina III.
A solicitação está correta?
O laboratório deve realizar os exames?
A solicitação está absolutamente correta. Deveria, ainda, ter sido solicitada a pesquisa do valor V de Leiden. O laboratório não deve realizar a dosagem das proteínas S e C.
A dosagem da antitrombina e a pesquisa do valor V de Leiden podem ser realizadas. As proteínas S e C são os fatores dependentes de vitamina K e a vigência do anticoagulante oral há deficiência de vitamina C, acarretando valores baixos dessas proteínas. O ideal é que estes exames sejam realizados 30 dias após a suspensão do anticoagulante oral.
Homem, 42 anos, realizou exames laboratoriais para elucidar dor abdominal. Entre os exames solicitados estava o hemograma cujo resultado foi normal para as series vermelha e branca. A contagem de plaquetas foi de 4.000 plaquetas/microlitro. O hemograma foi repetido e confirmado.
Qual o provável diagnóstico para este paciente?
Que atitude clinica pode ser tomada?
Foi eliminada a possibilidade de agregação plaquetária induzida pelo anticoagulante e o paciente tem queixa de dor abdominal, causada por esplenomegalia. A trombocitopenia é real e causada por hiperesplenismo ou este ocorreu pela destruição maior de plaquetas (causada por anticorpos dirigidos contra plaquetas). A atitude clínica foi instalação de terapia com corticoide, a resposta do paciente não foi boa. O uso de imunoglobulina também não teve boa resposta. O paciente foi submetido à esplenectomia e houve recuperação do numero de plaquetas.
Homem, 31 anos, há uma semana sendo medicado por um quadro de infecção pulmonar, iniciou quadro de febrícula e fadiga intensa. Foi solicitado hemograma, a série vermelha mostrou anemia moderada normocítica e normocrônica com a presença de esquizócitos (++), a série branca mostrou leucocitose moderada à custa de neutrofilia com discreto desvio a esquerda e plaquetas com morfologia normal e contagem de 9.500 plaquetas/microlitro.
Estes exames falam a favor de qual quadro clínico?
O quadro laboratorial é compatível com púrpura trombocitopênica trombótica em decorrência da presença de esquizócitos e da queda no número de plaquetas.
Este é um quadro grave em que a equipe médica deve ser avisada de imediato. O quadro clinico de PTT deve estar associado ao processo infeccioso.
Mulher, 42 anos, foi internada para a realização de histerectomia. No dia seguinte ao procedimento cirúrgico iniciou quadro de dor no peito, tosse produtiva e febre. Foi solicitado hemograma, que apresentou um resultado compatível com anemia discreta, normocrítica e normocrônica, não hemolítica, leucócitos normais com intenso desvio à esquerda e contagem de plaquetas de 30.000/microlitro.
O hemograma é compatível com o quadro clinico?
Que outros exames podem ser feitos para auxiliar no diagnóstico?
O que chama a atenção no hemograma, além da trombocitopenia, é o intenso desvio a esquerda com leucócitos normais. A explicação pode ser de um consumo tecidual elevado (processo infeccioso), que exige uma produção de neutrófilos imediata e sem tempo para a completa maturação. Este quadro leucocitário é compatível com uma produção menor que o consumo. A trombocitopenia pode ser decorrente da formação de trombos, pela ativação plaquetária causada pelo processo infeccioso; portanto, uma queda no numero de plaquetas por consumo. Este quadro pode ser compatível com septicemia. Devem ser realizados exames de coagulação (TP, TTP, fibrinogênio e D-dímero) em razão da possibilidade de coagulação intravascular disseminada.
Homem, 64 anos, foi ao laboratório para realizar exames de rotina. Durante todo o tempo em que permaneceu no laboratório, reclamou de dor, inchaço e de vermelhidão na panturrilha esquerda. O coletador chamou o responsável pelo laboratório em razão da queixa contínua.
Que orientação deve ser dada a este paciente?
O paciente deve procurar um médico de imediato porque pode estar fazendo um episódio de trombose.
Homem, 68 anos, tem diagnóstico de hepatite C. Realizando exames de controle, teve um TTP e um TP bastante elevados.
Quais as explicações para o aumento do TP e do TTP?
O aumento do TP e do TTP pode ser em função do comprometimento hepático, mas a hepatite C está associada ao desenvolvimento de anticoagulante lúpico, que deve ser pesquisado. Como explicado no CSL 3, o plasma do paciente deve ser misturado com um pool de plasma normal se não houver correção do TP e do TTP, o Anticoagulante lúpico está presente.
Mulher, 40 anos, foi ao laboratório para realizar exames pré-operatórios que estavam normais; o que chamou a atenção foi o TTP= 28 segundos (CN+ 35 segundos).
A paciente apresentava um estado de hipercoagulidade?
Como deve ser interpretado o resultado do TTP?
A paciente não apresenta estado de hipercoagulabilidade, este estado está relacionado à trombofilias. A concentração de fator VIII varia bastante na população normal
(entre 80% e 140%), pessoas com altos níveis de fator VIII podem apresentar um TTP abaixo do normal sem refletir qualquer patologia.
Obrigado !
Maristela B. Biermann
maristela.biermann@dasa.com.br
Importância de comunicar Pânico-Tratamento da Hipocoagulação excessiva:
C=(1,85x10-3)(100-HCT)(V sangue)
Onde, C= Volume de citrato;
HCT =Hematócrito do paciente
V= Volume de sangue adcionado (se o tubo for de 5mL, então o volume será 4,5mL).
Para Hematócrito abaixo de 20%, não há informações disponíveis que sustente recomendação específica.
Full transcript