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생쥐해부를 통한 면역세포 분리 및 분포 분석

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by

형빈 김

on 16 January 2016

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Transcript of 생쥐해부를 통한 면역세포 분리 및 분포 분석

prep용 medium(RPMI1640), 15ml tube, ice, micropipette, 수술도구( 큰가위, 작은가위, 핀셋 2개, 수술용 pad, 알코올, 멸균가아제(거즈)
실험재료
Ab mixture를 제조하여 32.5㎕씩 Mixture에 맞게 용량대로 tube에 넣어준다.
실험 재료
B, T Cell 분포
생존 세포
실험 목적
Mouse의 Immune Cell 분석
실험 결과
생쥐해부를 통한 면역세포 분리 및 분포 분석
조유나, 이병혁 실습선생님
12조 조원
김형빈
최민주
박서영
정민영
박주명
김태경
지도: 해부학교실 홍창완 교수님
목차
1. Mouse의 면역세포
2. Mouse의 Immune cell 분석
용어 + 개념 정리
실험 목적
실험 결과
실험 방법
느낀점
용어 정리
-형광물질-
H57 : T cell과 반응하는 antibody
B220 : B cell과 반응하는 antibody
IL7Rα : 생존신호를 감지하는 수용체
(cytokine 수용체)
Leu4 : 사람에게 반응
(IL7Rα의 대조군의 역할을 함)
Mouse의 Immune cell를 prep하여 조건(4℃, 37℃)에 따라 배양하여 T and B cell 분포 및 여러 cytokine 수용체의 발현변화를 FACs(고처리 유세포 분석기)를 통해 확인한다.
Mouse의 면역세포
Lymph node : 생체 내에서 전신에 분포하는 면역기관의 일종으로, 내부에 림프구가 포함되어 있다.
Mouse
실험 방법
1) mouse lymph node 적출
mouse 등 쪽 가죽을 가위로 잘라서 mouse를
옆으로 둔 채로 가죽을 양옆으로 벗긴다.
lymph node를 떼어내서 담가두기 위하여
6-well plate에 배지를 2ml 씩 분주한다.
mouse를 경추 탈골한 다음 알코올로 흠뻑 적신다.
허벅지, 앞발, 겨드랑이, 침샘, 소장아래에 lymph node 총 12개를 적출한다.
침샘 5
겨드랑이 2
앞발2
복부 1
허벅지 2
쥐 해부 사진
심장이나 비위가 약하신 분들은
보기를 삼가주시기 바랍니다!
실험 방법
2) 면역세포 prep
slide glass의 거친 부분에 medium을 적당히 묻힌다.
왼쪽에 든 slide glass위 거친면에 lymph node 5-6개 정도 묻힌다.
평행이 되도록 나머지 slide glass를 올려서 으깬다.
prep이 다 끝나면 나머지 medium 5ml을 추가적으로 넣어 Pipette aid로 섞어주면서 cell을 풀어준다.
15ml tube에 filter용 거즈를 올리고 으깬 cell 용액을 pipette으로 여러번 섞어준 다음 걸러준다.
지름 10cm dish에 RPMI1640 medium을 5ml정도 붓는다.
실험 방법
3) Cell culture
배양을 마친 cell을 분리한 뒤 1500rpm에 4℃에서 3분간 centrifuge하여 cell만 분리하여 준다.
상등액만 버리고 5000000/ml이 될 수 있도록 medium을 넣어 cell pallet을 풀어준다.
준비해둔 plate에 cell을 seeding한 후 4℃, 37℃에서 각각 overnight(12hr)배양을 한다.
개념 정리
선천성 면역
후천성 면역(B, T Cell)
FACS tube(유리관), micropipette, FACS antibody (IL7Rα, Leu4, H57, B220), filter용 거즈, FACS buffer(세척액)
culture한 cell을 잘 섞어준 다음 FACS tube를 준비한다.
Facs tube에 Immune cell들이 각각 2000000/ml씩 들어가도록 넣어준다.
2번 tube에 FACS buffer 3ml씩 넣어준다.
tube들을 centrifuge rack에 옮겨
1500rpm에 4℃에서 3분간 원심분리를 한다.
상등액 버리고 FACS rack을 이용해 pallet을 풀어준다.
실험 방법
실험 방법
Ab가 잘 섞일 수 있도록 rack을 이용해 풀어준 후, 30분간 4℃에서 냉장보관 한다.
FACS buffer 300㎕씩 넣고 rack을 이용하여 pallet을 풀어준다.
준비한 new tubes 입구에 핀셋으로 filter을 올려놓고 filtering 한 후 ice에 박아둔다.
1) mouse Immune cell staining
1) mouse Immune cell staining
single staining한 sample을 차례대로 고처리 유세포 분석기(FACS)를 통해 확인하여 compensation을 맞춰준다.
실험 방법
compensation을 다 맞춘 후, 준비해간 sample을 순서대로 고처리 유세포 분석기(FACS)로 읽어주면 된다.
sample을 다 읽어 저장한 후 저장한 sample을 분석하여 비교한다.
2) Cell population 분석
T Cell
B Cell
비교 : 4℃ 와 37℃ 배양했을 때 세포분포
4℃
37℃
4℃
37℃
4℃
37℃
4℃
37℃
느낀점
들어주셔서 감사합니다.
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