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Tecnicas de Citopreparación

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by

norland hernandez

on 22 February 2015

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Transcript of Tecnicas de Citopreparación

Se introduce la muestra inmediatamente en un medio líquido para su fijación, hasta que llega al laboratorio.

Funciones del fijador.
Mantener la morfología.
Detener la citolisís.
Facilitar el proceso de tinción .
Adherencia de las células al portaobjetos.
Preservar las células.
Mantiene en un estado adecuado, las células por largo tiempo

Método progresivo
Núcleo teñido con hematoxilina.
Es el mas común.
Mas facil de controlar y da mas estabilidad.

Otros.
Medio de montaje.
Filtración
Alcoholes
Lavado de cristalería.
Método progresivo
En la método progresivo el nucléolo tiende a ser mas oscuro o muy pálido debido a :
Solución de Hidroxido de amonio demasiado fuerte o demasiado vieja
El tiempo de la hematoxilina no es el indicado.
Lavado de la hematoxilina.
Procedimientos de tinción basados en el método de papanicolao
Principales problemas en los procedimientos de tinción
Tecnicas de Citopreparación
Fijadores:
Alcohol al 95%
Isopropanol al 80%
Metanol al 100%

Fijación liquida:
Fijación con secado al aire:
Se sumerge la muestra inmediatamente a la solución.
Después de un tiempo específico se saca y se deja secar al aire
En el laboratorio, se colocan en Alcohol al 95% antes de la tinción.

Fijación con Spray:
Se aplica el spray sobre la muestra.
Se deja secar al aire
Se coloca en un recipiente para ser trasladado al laboratorio.
El fijador es removido antes de realizar la tinción.

Proceso de eliminación del la capa de spray:
Dos contenedores con alcohol de 95%
También se puede utilizar agua
Problemas en la tinción si no se elimina completamente.

Fijadores en spray:
Generalmente estos fijadores consisten en una base de alcohol y carbowax.
Generan un capa delgada protectora a las células.
Se recomienda el uso de aerosoles ya preparados y no emplear otro tipo de mezclas, puede alterar la calidad de la muestra.

Fijación de BAAF y bloque celular.
BAAF generalmente se utiliza alcohol al 95%
Para el bloque celular se utiliza etanol o acetona

Adherencia de las células al portaobjetos:
Depende de: tipo de muestra que sea, y la condición del tejido.
Por ejemplo, células de la orina tienen una adherencia menor a un portaobjetos de vidrio que las células de una muestra de esputo.
Las células del cuello uterino normal, se adhieren mejor al portaobjetos que las células con una enfermedad inflamatoria o secreción excesiva.

Método de tinción de PAP:
Es una tinción con mucha aceptación, por su método simple.
Las modificaciones de la técnica varían de un laboratorio a otro.
Importante el tiempo que se coloca la muestra en los colorantes de Hematoxilina y EA.
En los laboratorios es aconsejable usar un método estandarizado, para obtener resultados reproducibles.

Factores que afectan la tinción de Papanicolaou:
Tipo de fijador utilizado.
El tipo de método de tinción utilizado ( regresivo o progresivo )
Tiempos de tinción.
Numero de láminas teñidas.
Calidad de la muestra de células preparada por el clínico.
pH de la muestra

Proceso para evaluar la tinción de hematoxilina intensa
Fijar tres muestras bucales inmediatamente en alcohol de 95%.
Sumerga una de las laminas a traves de dos cambios de agua a hematoxilina.
Después de la tinción en hematoxilina, seguir el plan de tinción solo de agua, acercandose a etanol 95% a alcohol absoluto a xileno y montar.

Para evaluar el OG y EL EA, omitir el lavado en agua, tomar una muestra directa de cada tinción a través de 95% etanol a alcohol absoluto a xileno y montar.
Método regresivo
Sobretinción del núcleo. Removido con una solucion de acido hidroclorico. Este debe estar bien regulado porque de ello depende el patrón nuclear.

Tinción del núcleo con hematoxilina.
La calidad de la fijación y la forma en la que las soluciones son utilizadas pueden provocar deficiencias.
Registrar cuando ingreso el tinte y cuando este se abrió es un dato importante.
La oxidación, el mordiente, el solvente y la sustancia utilizada para acidificación, ayudan a la hematoxilina a ser un tinte usable.

El agente de oxidación es utilizado para empezar el proceso de maduracion, transformando la hematoxilina en hemateina, que es el agente colorante activo.
Sodio iodado y oxido de mercurio

El mordiente es la sustancia encargada de la inducción del color en el tinte. Sulfato de aluminio
El solvente es la sustancia que disuelve hemateina en la solución. Actúa como un agente de nivelación y permite reducir la velocidad de oxidación Etilen glicol
Acidificador, asegura la selectividad del material nuclear y ayuda a prevenir la oxidación del tinte . Ácido acético glacial y el ácido cítrico tienen este propósito.


Comparación
Con el método progresivo:
La cromatina es una estructura finamente distribuida, hipercromasia acentuada y tinción moderada de la cubierta del núcleo
Con el método regresivo:
El núcleo esta teñido fuertemente y en distribucion uniformemente con incremento de las zonas de hipercromasia.

Contrarestante del tinte: orange g y EA
Método Regresivo
Núcleo demasiado oscuro:
Exceso de tinción, hematoxilina de Harris
No remover el exceso de hematoxilina durante del procedimiento de lavado.
La concentración de acido clorhídrico no es la indicada o se sumergio 2 veces.
MUESTRAS GENITOURINARIAS DE LAS VÍAS Y OTROS ESPECÍMENES ACUOSOS
Tener en cuenta que…
Las variaciones en la celularidad y preservación de células también pueden ser reflejados en diversas enfermedades urológicas.
La preservación de la células es más difícil, cuando éstas han dejado el cuerpo.
La muestra de orina puede sentarse a temperatura ambiente si se prepara el mismo día en que se obtuvo.
Si se deja durante la noche o fin de semana, ésta se puede refrigerar ya que retarda la degeneración celular, cosa que no hace el etanol.
Pero si va a tardar más de 62 horas, mejor dejar dos partes de orina y una de etanol de la muestra, preferiblemente refrigerada.

Preferiblemente no preparar en frío, ya que las sales se cristalizan y pueden obstruir el filtro.
Si la muestra se recolecta en un fijador de alcohol, es difícil que las células se adhieran al portaobjetos.
Las células recogidas en alcohol tienden a redondear, endurecer y se da picnosis nuclear se produce con frecuencia.
Si la muestra se ha fijado en una suspensión, se debe centrifugar, el sobrenadante se vierte, y el sedimento se suspende, preferiblemente en solución salina equilibrada, antes de su procesamiento posterior.

Procedimiento para frotis directos
Etiquetar el recipiente de la muestra, formulario de solicitud, diapositivas y tubos de ensayo con el número de laboratorio, la identificación del paciente, y el tipo de muestra.
Coloque los recipientes de muestras en la capucha.
Coloque la muestra de líquido bien mezclado en dos tubos de ensayo de centrífuga separadas tapados y etiquetados de plástico desechables.
Centrifugar la muestra en tubos de ensayo de plástico de 50 ml durante 10 min a 2500 rpm.
Con cuidado decantar un tubo de ensayo. Guardar y refrigere el segundo tubo de ensayo.
Coloque una gota de azul de toluidina en el portaobjetos de vidrio con una gota de sedimento con una pipeta desechable.
Mezclar gotas junto con un aplicador limpio.
Cubra con cubreobjetos.
Espere 1 min.

Procedimiento para cytospin
Retire los especímenes de la nevera y el lugar en el capó. Nota: Los especímenes son más fáciles de preparar cuando a temperatura ambiente.

Coloque la muestra de líquido bien mezclado en dos tubos de ensayo de centrífuga separadas, tapados y etiquetados de plástico desechables.

Centrifugar la muestra en tubos de ensayo de centrífuga de 50 ml de plástico durante 10 min. Las muestras de orina se centrifuga durante a 2000 rpm.

Tracto Respiratorio y Muestras Mucoides
Agite suavemente la muestra.
Verter hasta 45 cc de líquido en el tubo de centrífuga.
Equilibre el tubo con un tubo de igual volumen.
Centrifugar la muestra a 1800 rpm durante 5 min.
Retirar el sobrenadante en el recipiente de la muestra inicial.
Repetir una o dos veces hasta que la muestra no se vea mucoide.
Preparar cuatro láminas de vidrio, adjuntar un cytofunel a cada una y pipetear de una a dos gotas en cada una.
Centrifugar equilibradamente configurado con el cytofunel.
Giro de 1200 rpm durante 4 min.

Fluidos Corporales
Medios de montaje líquidos
Los sustitutos de soluciones líquidas de montaje emiten vapores potencialmente tóxicos.
Producen una capa irregular sobre las células.
Pueden aumentar la decoloración, y que la superficie se agriete con el tiempo.
Distinción y retención de láminas
Tiempo varía según la cantidad y el tipo de montaje utilizado.
*El siguiente paso es la eliminación del colorante nuclear.
*Es generalmente necesario colocar el portaobjetos en ácido clorhídrico diluido, o bien una solución acuosa a base de alcohol.
*La eliminación de hematoxilina puede tomar de 5 a 20 minutos o más, dependiendo del grosor de la muestra.
La lámina se enjuaga suavemente en agua del grifo durante 10­ a 15 min.
Eliminación manual del cubreobjetos
Porta objetos Recientes
Porta objetos viejos
Recolección y Procesamiento de Muestras no Ginecológicas.
Líquidos Corporales
La clasificación como exudado o trasudado es hecha basada en la densidad, contenido de proteína, y otros aspectos bioquímicos propios del líquido.

Los trasudados tienen una cantidad más baja de proteína y una densidad inferior que de los exudados.
Los Transudados suelen ser claros y por lo general estériles ,con un escaso número de células, predominantemente mesoteliales. Los Transudados no coagulan en reposo.
Los exudados son generalmente nublados y espumosos, suelen ser ricos en fibrina y en proteína, y puede coagular en reposo

La evaluación de lavados peritoneales se puede utilizar en la estadificación de los tumores malignos de ovario en las pacientes tratadas.
Un falso negativo puede deberse a la baja celularidad por recolección indebida, la preparación inadecuada o mala exfoliación de la cavidad.
La Tuberculosis, infecciones virales y parásitos como Strongyloides stercoralis y Pneumocystis cariNII, pueden estar presentes en los derrames.

El método de la citopreparación se puede seleccionar según las propiedades físicas del espécimen y de la historia del paciente.
El citotecnólogo necesita de información clínica pertinente a la mano que se correlacione con los hallazgos celulares.
La variedad y tipos de muestras celulares requeridas para los propósitos de citodiagnóstico de rutina, estudios inmunológicos, la evaluación microbiológica, y tinciones especiales se pueden preparar antes de la actual evaluación citológica.

Preparación líquido cefalorraquídeo
Preparación líquido cefalorraquídeo.
La preparación y tinción de LCR se realiza por separado de otras muestras de líquidos.

Varios métodos de citopreparación son de uso corriente: centrifugación, frotis directos y citocentrifugación.

Si se utiliza el método de frotis directo, es sugerido un adhesivo, tal como polilisina, dextrano, o albúmina de Mayer.

La prefijación con alcohol no es recomendada porque el alcohol puede precipitar cualquier proteína presente en la muestra de fluido.
Todos los equipos de preparación, así como las tinciones se mantienen separadas de todos los demás fluidos.
El equipo es marcado de manera que no se confunda con otra preparación de fluidos corporales.
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