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ADNcl

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by

Andrea Montalva Beck

on 14 August 2013

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Transcript of ADNcl

Clonación de ADN
Introducción
Estudio del ADN: importante impacto ->biología celular, temas éticos y sociales.

ADN recombinante: combinación ADN de diferentes organismos ->obtener copias de segmentos específicos.

Tecnología del ADN recombinante: desarrollo lento, antecedentes en experimentos con bacteriófagos.


Enzimas de restricción: "tijeras moleculares"
Científicos: ADN cromosómico fragmentos más cortos.
ADN recombinante: se forma cuando se inserta ADN en un vector
Genetistas: ADN plasmídico y foráneo con la misma enzima se mezclan, forman enlaces de H y se sellan con ADN ligasa.
El ADN se puede clonar dentro de las células
Métodos para aislar un gen, aplicables a cualquier organismo.

Se replican y distribuyen a células hijas- también los plásmidos recombinantes (que poseen ADN foráneo y producen copias de éste.)

ADN bacteriano: circular.
Plásmido: molécula de ADN circular separada, mucho más pequeña. Se encuentra y replica en células bacterianas.
Entran por transformación, modificación química o electroporación.
Tras la unión de extremos cohesivos de 2 moléculas, sobre ellos actúa la ADN ligasa, formando una molécula de ADN recombinante estable.
Corte de ADN con enzima HindIII (Haemophilus influenzae). Secuencia palindrómica. Extremos cohesivos complementarios.
Plásmidos empleados actualmente: modificados características útiles
Vectores
Limitante: tamaño del fragmento de ADN que pueden transportar.
Plásmidos: menos de 10 kb ( ), hasta 23 kb (bacteriófagos).
Vectores de clonación cósmidos: combinados, características de ambos.
Cromosomas bacterianos artificiales (BAC): hasta 200 kb extra, útiles en PGH.
Virus activados para evitar la muerte las células que infectan (eucariontes).
Genotecas de ADN genómico y cromosómico
Genoteca de ADN genómico: fragmentos de todo el ADN de una célula, almacenados en bacterias recombinantes.

Genoteca cromosómica: conveniente cuando se conoce la ubicación de un gen.


Vector plasmídico modificado genéticamente y con características útiles. Construido con fragmentos de ADN de plásmidos, genes de y levaduras. Posee 2 orígenes de replicación y genes de resistencia a antibióticos.
Tamaños: plásmido y ADN principal.
Plásmido de
Producción de una genoteca
Se corta ADN con enzima de restricción. Fragmentos son tratados con enzimas de restricción (se vuelven lineales)
Se forma ADN recombinante: ligasa.
Se introducen plásmidos en células bacterianas sensibles a antibióticos.
Se incuban en medio nutritivo con antibióticos
Sonda Genética
Cada plásmido contiene un fragmento del total del genoma humano.

Ientificación de un plásmido con una secuencia de interés: el investigador clona plásmidos (división y crecimiento de bacterias) colonia visible- clones.

Sonda genética: segmento de ADN parcialmente homólogo a secuencia de interés. Normalmente de cadena simple, marcado radiactivamente, puede hibridar a las secuencias complementarias del ADN blanco.
E. Coli.
E. Coli
E. Coli
Réplica de colonias, células lisadas, hibridación, rayos X.
Una genoteca de ADNc es complementaria al ARNm y no contiene intrones
Construyen genotecas de ADN complementario: genotecas de copias de ADN del ARNm maduro al que se le han eliminado los intrones.

Análisis de clones de ADNc: determinar características y secuencia de aminoácidos de la proteína codificada en el gen, estudiar ARNm maduro. Comparación con ADN genómico determinar localización de secuencias codificadoras.
Producción de proteínas eucariontes en bacterias (bacterias no pueden eliminar intrones).
Conclusión
Proceso por el que se consiguen, de forma asexual, copias idénticas de una molécula, célula u organismo.

Definición
Del griego : retoño
^
Conjunto de fragmentos idénticos de ADN obtenidos de una misma secuencia.
Organismos o células genéticamente idénticos, formados por reproducción asexual o división artificial de estados iniciales de su desarrollo.
klon
Enzimas de bacterias, cortan ADN en sitios de corte específicos (defensa contra bacteriófagos).
Cortan ambas cadenas de forma desigual: fragmentos de cadena simple, complementarios y de extremos idénticos (cohesivos- puentes de hidrógeno).
Muchas cortan secuencias palindrómicas.
(origen de replicación, 1 o más sitios de restricción, genes que permitan selección de células transformadas- condiciones específicas de crecimiento).
Aplicaciones: experimentos biológicos, producción de proteínas a gran escala.
Transcriptasa inversa: sintetiza ADNc de cadena simple, a partir de ADN (insertado por plásmido o vector vírico) que después se separa del ARNm y se vuelve doble con polimerasa.
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