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Gentechnik

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by

Henrick Meurer

on 23 February 2014

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Transcript of Gentechnik

Unter Gentechnologie/Gentechnik versteht man Methoden zur:
Isolierung,
Charakterisierung,
Konservierung,
Synthese sowie
Veränderung
genetischen Materials und seiner Übertragung auf andere Organismen.

Definition
Gentechnik
Grüne Gentechnik: Anwendung in der Pflanzen-und Tierzucht

Rote Gentechnik: Anwendung in der Medizin

Bereiche der Gentechnik
1) Finden & Gewinnen von Genen

2) Schneiden von DNA

3) Übertragung von DNA

4) Selektion transgener Zellen
Grundoperationen der Gentechnik
Fremd-DNA lässt sich nicht gezielt in einen Vektor einfügen. Zudem ist unwahrscheinlich, ob die Transformation, die Aufnahme der Vektor-DNA in die Zelle, erfolgreich war. Dies muss nun in verschiedenen Verfahren getestet werden.
Selektion transgener Zellen
Drei Arten von Informationsträgern für die Gewinnung der DNA:
Die Basensequenz der DNA
Die Basensequenz der mRNA
Die Aminosäuresequenz des codierten Proteins
Finden & Gewinnen von Genen
Das wichtigste Werkzeug in der Gentechnik sind die Restriktionsenzyme. Sie werden zum einen zum Schneiden bzw. Aufschneiden der
Spender-DNA und der
Transport-DNA verwendet.

Schneiden von DNA
Rekombinante DNA kann nur dann in Genprodukte umgesetzt werden, wenn sie in eine Wirtszelle geraten. Dafür werden häufig Vektoren verwendet.

Übertragung von DNA
Bei Zellen, die darauf spezialisiert sind, ein bestimmtes Protein herzustellen, wird die mRNA für dieses eine Protein extrahiert und durch das Enzym reverse Transkriptase in DNA umgewandelt.
Danach synthetisiert die DNA-Polymerase den komplementären DNA-Strang.
Die so entstandene cDNA (copy-DNA) ist die exakte DNA-Kopie der mRNA.
Restriktionsenzyme lassen sich aus
Bakterien gewinnen, die ich mit
diesen vor eingedrungener Fremd-DNA
aus z.B. Bakteriophagen schützen. Die Besdonderheit der Restriktionsenzyme ist,
dass sie nicht am Ende der DNA ansetzen,
sondern sie von innen heraus zerschneiden.
Dabei hat jedes Restriktionsenzym seine
spezifischen "Schnittstellen" (EcoRI z.B. immer
zwischen Adenin und Guanin)
Durch die spezifischen Schnittstellen der Restriktionsenzyme enstehen sogenannte klebrige Enden ("sticky ends").
Da jede DNA mit demselben Enzym geschnitten wird, kann sich die Spender-DNA perfekt durch die "sticky ends" an die Transport-DNA anlagern, wo sie dann durch das Enzym Ligase miteinander verbunden werden.
Vektoren sind DNA-Moleküle
(Plasmide oder Viren), die
bestimmte Eigenschaften haben
müssen.
Sie müssen:
replizierbar sein und
Markergene enthalten.
Vektoren sind häufig aus verschiedenen Plasmiden zusammengeschnitten, um möglichst beste Voraussetzungen für den Versuch zu gewährleisten.
Ein häufig verwendetes Plasmid ist
pBR322, welches ein Gen für die
Resistenz gegen Tetracyclin (aus dem
Plasmid pSC101) und gegen Ampicillin
enthält.
Zum Einschleusen fremder Gene
in Pflanzenzellen dient häufig ein
Plasmid aus dem Bodenbakterium
Agrobacterium tumefaciens.
Eine andere Möglichkeit die
rekombinierte DNA in die Wirtszelle
zu injezieren ist die
direkte Genübertragung.
Inkubation
Fremd-DNA wird durch Endocytose
in Protoplasten aufgenommen.
Dann legt man für einige Millisekunden eine hohe Spannung an, die die Zellmembran dazu veranlasst Poren zu bilden, durch welche die DNA in den Zellkern vordringen kann.
Elektroporation
Partikelbeschuss
Hierbei werden winzige Gold-
oder Wolframkügelchen mit der
Fremd-DNA überzogen und dann
mit hoher Geschwindigkeit in die Pflanzenzelle geschossen.
Nachteil:
Die Zelle wird dabei möglicherweise beschädigt bzw.
zerstört.
Mikroinjektion
Die Fremd-DNA wird mithilfe einer
feinen Hohlnadel oder Mikrokapillare
in die Zelle injeziert.

Grüne Gentechnik:

bestimmte Nutzpflanzen werden genetisch verändert, um sie resistent gegen Schädlinge zu machen. -> "Genmais"
Aber auch durch Auslesezucht und Kreuzungs-oder kombinationszucht versucht man gewisse Eigenschaften der Pflanze gezielt weiterzuvererben
Rote Gentechnik
Bei der Übertragung von Fremd-DNA auf Plasmide entstehen im Reagenzglas DNA-Ringe mit und ohne Fremd-DNA.
Das Problem ist, dass sich beides nicht unterscheiden lässt
meistens in der medizinischen Diagnostik verwendet
man versucht mittels verschiedenster Tests die Ursachen für genetisch bedingte Krankheiten zu ermitteln, um so den Ort der Mutation herausfinden zu können
Transformation
Anschließend wird der Mischung eine Kultur von Empfängerzellen dazugegeben.
Das Plasmid pBR322 enthält zwei Resistenzgene gegen die Antibiotika Tetracyclin und Ampicillin.
Nun nimmt man ein Restriktionsentym, welches das Resistenzgen gegen Ampicillin aufschneidet und es somit unwirksam macht. In Plasmiden ohne das eingefügte Fremdgen bleibt die Resistenz
bestehen.
Selektion
Anschließend gibt man DNA-Ligase dazu, welches die Plasmide wieder schließt.
Um herauszufinden, welche Plasmide nun die Fremd-DNA enthalten, werden sie auf einem
Tetracyclin-Nährboden kultiviert. Dabei gehen alle Zellen zugrunde, die kein Plasmid aufgenommen haben, da das Resistenzgen für Tetracyclin im Plasmid enthalten ist.
-> hierzu ist der genetische Fingerabdruck von Bedeutung und das Sichtbarmachen durch die Genelektrophorese
Alle Zellen mit Plasmid und somit auch der Tetracyclin-Resistenz wachsen zu Kolonien heran.
Übertragung der Zellen auf einen Nährboden mit Ampicillin
Da auf dem Nährboden
mit Ampicilin nur Bakterien
mit Plasmiden ohne Fremd-DNA
wachsen können, kann man die Zellen identifizieren, die von transformierten Bakterien stammen.
Der genetischer Fingerabdruck/
Fingerprinting
Zunächst vervielfältigt man das genetische Material mittels PCR
sogenannte Restriktionsenzyme werden hinzugefügt -> schneiden die Introns heraus, welche wesentlich stärker variieren als Exons (besonders hochrepetetive Sequenzen unterscheiden sich in ihrer Länge)
Bei der Gelelekrtophorese werden die Proben in ein Polymer Gel/Agarosegel gegeben
Der Aufbau wird unter Spannung gesetzt -> Restriktionsfragmente wandern zum Minus-Pol
kurze Fragmente wandern schneller als längere
Fragmente gleicher Länge langern sich in der gleichen Bande an
Sichtbarmachen der Banden mittels eines Farbstoffes
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