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Untitled Prezi

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by

Yolitzin Gutierrez

on 14 February 2013

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Transcript of Untitled Prezi

OBJETIVO:


Al finalizar la práctica, el alumno a de ser capaz de:

Conocer como purificar linfocitos a partir de sangre periférica y de bazo, mediante estratificación sobre Ficoll-Hypaque y centrifugación.

Observar, contar y determinar la viabilidad celular los linfocitos presentes en una suspensión

Distinguir las células vivas de las células muertas hacer los cálculos necesarios para ajustar la concentración de linfocitos Esquema de la formación de rosetas en linfocitos T de cerdo con eritrocitos de carnero. PRACTICA No. 2 Departamento de Microbiología
Academia de Inmunologia
Carrera: Medicina 3er. semestre Dra. Elena Montañez Díaz AISLAMIENTO de células mononucleares (linfocitos) a partir de sangre periférica.
CUENTA CELULAR Y VIABILIDAD Fundamento

- Aislamiento separación de poblaciones y subpoblaciones comportamiento Estudios poblacionales de linfocitos Separación de linfocitos en función a:

1. características físicas de la célula
2. Capacidad de adherencia a sustratos

Aislamiento de linfocios basado en: la velocidad de sedimentación o centrifugación en un gradiente de densidad (Ficoll=separación por peso).

Evitar monocitos pues comparten receptores con células B Estudios poblacionales de linfocitos Recuento: LT posee Ag (CD2) específicos en su superficie son usados de marcadores para recuento

B: marcadores de Ig, receptores para Fc, receptores C3 de complemento

1) producción de Ig capacidad funcional

Considerar: 2) Respuesta a mitógenos

3) citotoxicidad celular Estudios poblacionales de linfocitos Proliferación frente
a mitógenos Linfocitos activados. lectinas
vegetales. + L Transformación linfoblástica: mide proliferación frente a un Ag. Ej PPD

Cultivo mixto de L: mide proliferación frente a linfocitos de otro individuo

Proliferación frente a mitógenos: fitohemaglutinina (PHA), concanavalina (ConA), lectinas vegetales. El estudio de proliferación linfocitaria puede hacerse en 3 pruebas:
Separación de células mononucleares con:

1. Solución de Ficoll-Hypaque (polímero de sacarosa de alto peso molecular)
2. Un compuesto orgánico iodinatado (diatriazoato de sodio, 3-5 bis
acetilamino-2,4,6 ácido triyodobenzóico), el cual tiene una densidad
de 1.077 g/ml que es idéntica a la de los linfocitos y monocitos.

Granulocitos y eritrocitos tienen una mayor densidad, al centrifugar
la sangre en el gradiente de Ficoll-Hypaque, pasan a través de éste
forman un paquete en el fondo del tubo. FUNDAMENTO:
PURIFICACION DE LINFOCITOS
Las plaquetas densidad menor permanecen en
la fracción plasmática y los mononucleares se
localizan junto con los linfocitos es necesario
purificar los linfocitos, mediante centrifugación
a una baja velocidad y a una alta velocidad
para eliminar plaquetas y monocitos respectivamente. FUNDAMENTO:
PURIFICACION DE LINFOCITOS Otras soluciones para la separación de mononucleares utilizando gradientes de densidad es el percoll (solución de partículas coloidales que contienen polivinilpirrolidona), este se usa más frecuente para la separación de monocitos, granulocitos, eliminación de blastos y células muertas.




Soluciones comerciales como el Lympphoprep, lymphopure o Hystopaque Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968)

Humanos: Sangre Periférica – Organos  Técnicas para el estudio de linfocitos Rendimiento: 1-2 x 106 cel / ml Importante conocer si se requiere esterilidad . M. experimental: bazo, timo   
Determinación de marcadores y receptores de membrana.

Determinación de antígenos de membrana.

Pruebas funcionales.  Técnicas para estudio de linfocitos Los principales marcadores son:  Marcadores y receptores de membrana.

Utilizados para diferenciar y cuantificar poblaciones de linfocitos B y T.

Están basados en las características
específicas de ciertos receptores de
membrana, presentes en ambas
poblaciones de linfocitos. TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS  Linfocitos T Linfocitos B Separación Identificación 2. Antígenos de membrana: Expresión diferencial de
marcadores de superficie y disponibilidad de AcMo con especificidad deseada
 

Técnicas:

- Lisis Ac/Complemento
- Panning.
- S. Magnética
Análisis por citometría de flujo.
- Inmunohistoquímica.
                                                                                                                                                                                                         Ventaja: pureza, reproducibilidad, manejo de cantidades variables de células
(106a 1010células).
Rendimiento: > 98% pureza Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados físicamente usando Acs acoplados a perlas magnéticas Análisis por citometría de flujo.
Costoso... Exacto, rápido y fácil en manos experimentadas

Inmunohistoquímica: Utilizando anticuerpos monoclonales,
marcados con fluorescencia o con peroxidasa, frente a
Los diferentes linfocitos, se puede valorar la situación de
estas células en cualquier tejido. Metodología: METODOLOGÍA: LT Obtención de sangre periférica

Se obtienen 5 ml de sangre venosa del sujeto en estudio en un tubo con heparina o ACD como
anticoagulante.

Purificación y conteo

Con una jeringa se toman 5 ml de SSF y se añaden a los 5 ml de la sangre y se mezcla bien por inversión.
De la sangre diluida se estratifican 5 ml sobre 2.5 ml de la solución Ficoll-hypaque contenida en un tubo de ensaye
Se centrifuga a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente
En la interfase entre el Ficoll-hypaque y el plasma diluido quedan los linfocitos los cuales se recuperan con una pipeta Pasteur.
Se transfieren las células a un tubo de ensaye y se lava por centrifugación 3 veces con SSF 1500 rpm durante 5 minutos (centrifuga clínica).
Las células recuperadas se cuentan y se ajustan a una concentración de 4x10 6 linfocitos/ml utilizando las cámaras de Neubauber. -En un tubo de ensaye se colocan 0.25 ml de la suspensión de eritrocitos de carnero al 1%.

-Se añaden 0.25 ml de la suspensión de linfocitos y se mezcla cuidadosamente.

-Se incuba a 37 ºC durante 15 minutos y se centrifuga a 500 rpm durante 2 minutos.

-Sin aspirar el sobrenadante se mantiene en refrigeración durante la noche.

-Al día siguiente se aspira parte del sobrenadante procurando no alterar las células sedimentadas.

-Con mucho cuidado se resuspende el paquete celular, se toma una gota con una pipeta pasteur y se coloca en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos.

-Se observan las rosetas en el microscopio con el objetivo 40X

-Se cuentan 100-200 linfocitos y se toman como rosetas aquellos que tengan 3 ó más eritrocitos adheridos a su superficie. SIGNIFICADO DE LOS VALORES ANORMALES SIGNIFICADO DE LOS VALORES ANORMALES SIGNIFICADO DE LOS VALORES ANORMALES Bibliografía

Los conteos anormales de células T y B sugieren posibles enfermedades y se necesitan pruebas adicionales para confirmar un diagnóstico.

Un incremento en el conteo de células T puede deberse a:
Mononucleosis infecciosa
Mieloma múltiple
Leucemia linfocítica aguda
Leucemia linfocítica crónica


Un incremento en el conteo de células B puede deberse a:
Leucemia linfocítica crónica
Mieloma múltiple
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Síndrome de DiGeorge

Una disminución en el conteo de células T puede deberse a:
Enfermedad por deficiencia congénita de células T
síndrome de Nezelof
síndrome de DiGeorge
síndrome de Wiskott-Aldrich

Estados de deficiencia adquirida de células T
infección por VIH
infección por HTLV-1

Trastornos proliferativos de células B
síndrome de inmunodeficiencia adquirida
leucemia linfocítica crónica
macroglobulinemia de Waldenstrom

Una disminución en el conteo de células B puede deberse a:
Leucemia linfocítica aguda
Trastornos congénitos por deficiencia de inmunoglobulina
Trastornos adquiridos por deficiencia de inmunoglobulina

- Trastornos proliferativos de células B
síndrome de inmunodeficiencia adquirida
leucemia linfocítica crónica
macroglobulinemia de Waldenstrom

- Una disminución en el conteo de células B puede deberse a:
Leucemia linfocítica aguda
Trastornos congénitos por deficiencia de inmunoglobulina
Trastornos adquiridos por deficiencia de inmunoglobulina Abbas, Abul K. Inmunología celular y molecular. 2007.
Kindt, Thomas J. Inmunología de Kuby. 2007.
Inmunología de Rojas. 2007.
Chapel, Helen. Inmunología clínica. 2001.
http://es.scribd.com/doc/19160630/Tecnicas-Para-El-Estudio-de-Linfocitos
http://www.vi.cl/foro/topic/5698-capitulos-de-inmunologa-apuntes/page__st__20 http://www.slideshare.net/legorretar/linfocitos-t
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