Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Expresión Inducible

No description
by

Álvaro Álvarez

on 13 November 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Expresión Inducible

El operón lac para expresión inducible
en ecuariotas
Revisión del operón lac
Función y componentes
Funcionamiento
La regulacion depende de represor lac (gen lacI)
El represor lac se produce de forma constitutiva
Es una proteína tetramérica
Se une al operador, impidiendo la transcripción
Funcionamiento
-Regula el transporte y metabolismo de la lactosa

-Escherichia coli y otras enterobacterias

-Promotor, operador, terminador y tres genes
En presencia de lactosa:

-Lactosa se une a represor
-Represor cambia de conformacion
-Represor no se une al operador
-Los genes se transcriben

Sistema LacSwitch II (Stratagene)
Vector pCMVLacI
-Contiene el represor Lac
-Resistencia a higromicina
Vector pOPRSV
- Para expresión del gen de interés
- Sitio MCS
- Lleva el operador de lac
- Resistencia a neomicina
Vector pOPI3CAT
- Para expresión del gen de interés
- Sitio NotI para introducir el gen
- Lleva el operador de lac
- Resistencia a neomicina
Funcionamiento
1- Se transfectan dos plásmidos: pCMVLacI y pOPRSV o pOPI3CAT
(Transfección transitoria o estable)
(Cotransfección o transfección secuencial)

2- Selección de dobles transfectados: higromicina + G418

3- Crecimiento de la línea celular transfectada

4- Inducción con análogo de alolactosa: IPTG
Ejemplo de uso de LacSwitch II
- Estudio de las uniones intercelulares tipo gap (conexinas)
- Se usa una línea celular sin comunicación intercelular:
células N2a (neuroblastoma)
- Transfección con cDNA de conexina 43 (gen Cx43)
- ¿Cómo controlamos la expresión? --> Sistema LacSwitch II

1- Transfección con pCMVLacI (lleva el represor Lac)
2 - Selección con higromicina
3 - Transfección con pOPRSVI (operador + cDNA conexina Cx43)
4 - Selección de dobles transformantes con higromicina + G418
5 - Inducción con IPTG
Procedimiento
Evolución de la expresión en el tiempo
(western-blot)
Dependencia respecto de
la cantidad de inductor
Evolución de la expresión en el tiempo
(inmunotinción)
"Regulated Protein Expression in Mammalian Cells"
(Promega)
Expresión inducible
Álvaro Abella Bascarán
Isabel Fernández Fernández
Rebeca Fernández Fernández
Introducción
Introducción
- Desarrollado por la empresa Promega en 2007
- Cotransfección de dos vectores de sistema
Flexi Vector
- Moduladores: coumermicina y novobiocina
- Transfección transitoria y estable
RM Flexi Vector Pf12
- Enzimas: SgfI y PmeI
- Compatible con Flexi-Vector
- Dos variedades
pReg neo
- Codifica el transactivador quimérico
- Autoamplificación
- Resistencia a geneticina
Mecanismo
Características
Moduladores
Transfección transitoria VS estable
z
Producción de proteínas recombinantes
Proteínas con:
- Puentes disulfuro
- Glicosilaciones
- Modificaciones proteolíticas
- Otras modificaciones post-traduccionales


Sistemas de expresión
eucariotas
Ejemplo: vacuna contra la hepatitis B
- Antígeno: Proteína de superficie (glicosilada)
- Expresión en Saccharomyces cerevisiae
- Vacuna obtenida sin oligasacáridos
- Efectividad igual a la plasmática
- Primera vacuna recombinante apta para su uso en EEUU
Sistemas de expresión eucariotas
Levaduras
Células de insecto
Células vegetales
Células de mamífero: mejor plegamiento, ensamblaje y modificaciones post-traduccionales.

Utilidad
:
- Confirmar que el gen codifica la proteína
- Estudiar la relación estructura-función de la proteína
- Aislar genes seleccionando las células que producen la proteína
- Producir proteínas poco disponibles
- Evaluar las consecuencias fisiológicas de producción proteica
- Estudiar mecanismos de regulación
Sistemas de expresión en células de mamífero:
constitutiva
Expresión génica sin inductor
Vector con gen recombinante y promotor (CMV, RSV, SV40)
Transfección transitoria o estable

Ventajas:
- Sin necesidad de inductor
- Expresión alta en células diferenciadas

Desventajas:
- Interferencia en el crecimiento celular
- Expresión baja en células no diferenciadas (elementos represores)
- Incremento en inestabilidad plasmídica
Sistemas de expresión en células de mamífero:
inducible
Expresión reprimida sin inductor
Sistemas de la tetraciclina, lac, ecdisona y Tet-On
Promotores inducibles por choque térmico, metales pesados o esteroides
Utilidad
:
Proteína que interfiere en crecimiento procariota
Diferentes condiciones óptimas de crecimiento y expresión
Sistemas de expresión en células de mamífero:
reprimible
-Expresión génica sin inductor, que se interrumpe con un represor
- Sistema de Tet-Off
Sistemas inducible y reprimible
Ventajas
:
- Regulación de la expresión

Desventajas
:
- Necesidad de inductor o represor
- Efectos pleiotrópicos de los inductores no químicos
- Actividad basal alta
- Bajo nivel de inducción
Fin
Full transcript