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Expresión y purificación de la proteína recombinante VP6 de rotavirus C en E. coli.

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by

Pablo Rado

on 18 July 2014

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Transcript of Expresión y purificación de la proteína recombinante VP6 de rotavirus C en E. coli.

Seminario de Investigación
de la carrera Licenciatura en Biotecnología

Expresión y purificación de la
proteína recombinante VP6 de
Rotavirus C humano en

Rotavirus
En 1973, la Dra. Ruth Bishop y sus colegas reportaron el descubrimiento del rotavirus humano y su asociación con diarrea severa endémica en infantes y niños jóvenes.
La identificación se realizó visualizando partículas virales por microscopía electrónica.
Estructura y proteínas
Es la causa más importante de gastroenteritis y diarrea viral en niños.
Los síntomas más severos se observan en niños menores a 2 años, pero infecta a personas de cualquier edad.
Pablo L. Rado
Directora: Lic. Rosana Rota

Proteínas antigénicas
La sintomatología puede variar entre una infección subclínica y una enfermedad deshidratante severa y ocasionalmente fatal.
Casos clínicos más frecuentes:
6 meses - 2 años.
Síntomas más comunes:
fiebre
y
vómitos
(2-3 días), seguidos de diarrea sin sangre.
La
primoinfección
presenta la mayor severidad clínica.
Aspectos clínicos
Estadísticas anuales

En el
mundo:
111 millones de casos.
25 millones de consultas médicas.
2 millones de hospitalizaciones.
440.000 muertes en menores de 5 años (82% en países en vías de desarrollo).

En
Argentina:
130.000 consultas médicas.
20.000 hospitalizaciones.
100 muertes, aproximadamente.
Epidemiología
Patrones de migración del ARN viral en PAGE:
análisis epidemiológico de cepas.
ELISA
es el ensayo más
usado.
Los
tests comerciales
son confiables pero
sólo detectan al rotavirus del grupo A (RVA)
.
PCR
se utiliza para la
caracterización de cepas.
Diagnóstico
Prevención
Evitar la
exposición
y la
diseminación
fecal-oral.

Existen
2 vacunas orales
licenciadas (Rotarix y RotaTeq), con aceptables niveles de seguridad y que
proveen excelente protección contra el grupo A, pero no contra los grupos B y C
.
Elección del sistema de expresión pET / Rosetta
Objetivo general
Expresar la proteína VP6 de RVC humano en
E. coli
para utilizarla como antígeno para el desarrollo de un método de diagnóstico.




1.
Expresar la proteína VP6 de RVC humano en
2.
Optimizar la expresión de la proteína recombinante.
3.
Purificar la proteína recombinante.
1. Obtención del plásmido de expresión pET/VP6
2. Optimización de la expresión
Determinación de la concentración bacteriana y tiempo óptimos de inducción
Ensayo de selección de colonias con alta expresión
Prueba de sulbactam (Bagó)
Temperatura de inducción
Otras concentraciones de IPTG para la inducción
3. Purificación
Análisis de la fase soluble y pellet de lisis
Familia: Reoviridae
Subfamilia: Spinareovirinae
VP4 y VP7 son importantes en la inducción de producción de anticuerpos neutralizantes.



Muy
conservada
dentro de cada grupo y altamente
inmunogénica
.
No induce la producción de anticuerpos neutralizantes pero es importante en la
inducción y modulación de una respuesta inmune protectora
.
Es una de las proteínas relevantes en el desarrollo de métodos de diagnóstico inmunológicos.
VP6
Propagación en cultivos celulares
Difíciles de cultivar in-vitro.

Se desarrollaron estrategias para cultivarlos utilizando cepas de rotavirus reasociantes o en forma directa usando líneas celulares específicas.

Los rotavirus del grupo B (RVB) y C (RVC) son aún más difíciles de cultivar.

Sólo unas pocas cepas de RVC porcino, una de bovino y una de humano han sido cultivadas.
Objetivos específicos
3. Purificación
Purificación con resina Ni-NTA (QIAGEN)
Conclusiones
Agradecimientos
¿Preguntas?
¡Muchas gracias!
Por lo tanto, los datos de
incidencia
no se corresponden
con los
altos niveles de seroprevalencia
registrados.
Rotavirus C (RVC) humano
Sabemos muy poco sobre RVC humano... ¿por qué?
Falta de
métodos de diagnóstico
Desafío: desarrollar un método
específico
y
confiable
Necesitamos
antígenos:
Partícula viral completa
Proteínas antigénicas (VP4, VP6, VP7)
Difíciles de cultivar!
Producción de VP6 de RVC humano en un
sistema heterólogo
Estudios de RVC humano realizados en LIV-UNQ
Se desarrolló un ELISA de detección basado en anticuerpos anti-VP6 de la cepa Cowden (porcina).
Se desarrollaron métodos de ELISA para detección de IgG específica contra los grupos A y C en suero de pacientes.
Con estos métodos se estableció la incidencia y prevalencia de la infección en el Gran Buenos Aires (GBA).
Castello, et al., J. Med. Virol. 81:1109–1116 (2009)
Edades de los pacientes afectados por los RV A y C
Incidencia y estacionalidad de los RV A y C (GBA)
Incidencia en diarreas (pacientes externos)
Grupo A: 24,5%
Grupo C: 3-4%

Estacionalidad invernal para RVA, pero no evidente para RVC.
Los pacientes infectados con RVC y RVA tuvieron una diferencia significativa en la media de sus edades.
Castello, et al., J. Med. Virol. 81:1109–1116 (2009)
Tasas de seropositividad para RVA y RVC por grupo etario en niños saludables (GBA)
Prevalencia de anticuerpos específicos para RVC (barras en blanco) y de RVA (barras en gris) en muestras de suero de 450 niños sanos.
Castello, et al. J. Med. Virol. 67:106-112 (2002)
Cepa: Rosetta
(deriva de la cepa BL21)

Suple tRNAs para 6 codones de uso infrecuente en , 3 de ellos utilizados en la secuencia codificante de VP6.
E. coli
E. coli.
Vector: pET-22b(+)

Producción de proteínas recombinantes en masa.
Permite fusión a cola de histidinas.
Internación por diarreas en Argentina e incidencia de los casos de rotavirus por edad (1-3 años). (Gentile A., et al., 2006).
E. coli
2. Optimización de la expresión
Primer ensayo de expresión en condiciones estándar
Detección de la expresión
Análisis de secuencia:
97-99% de identidad con 32 secuencias correspondientes al ORF codificante para la proteína VP6 de cepas de RVC humano.
81-83% de identidad con secuencias del ORF codificante para la proteína VP6 de cepas de RVC porcino.
ELISA de detección basado en anticuerpos anti-VP6 de la cepa Cowden (porcina) desarrollado por el LIV-UNQ (Castello A.A., et al., 2000)
Normalización de los resultados en función del control positivo
VR
(valor relativo) =

Abs. 490nm Muestra
Abs. 490nm Control (+)
Cultivo en medio LB
Inducción DO (600nm)= 0,6
[IPTG]= 1mM
Inducción durante 3 h.
VR=0,238
DO (600nm)= 1.
Período de inducción= 2:30 h.
2. Optimización de la expresión
DO (600nm)= 1.
Período de inducción= 2:30 h.
T°= 37°C.
2. Optimización de la expresión
DO (600nm)= 1.
Período de inducción= 2:30 h.
T°= 37°C.
[IPTG]= 1mM.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para las muestras de los cultivos inducidos y del cultivo de control.
2. Optimización de la expresión
DO (600nm)= 1.
Período de inducción= 2:30 h.
T°= 37°C.
[IPTG]= 1mM.
Colonia N°1.
2. Optimización de la expresión
DO (600nm)= 1.
Inducción= 2:30 h.
T°= 37°C.
[IPTG]= 1mM.
Colonia N°1.
Suplementación con sulbactam.
2. Optimización de la expresión
DO (600nm)= 1.
Inducción= 2:30 h.
T°= 37°C.
[IPTG]= 1mM.
Colonia N°1.
Suplementación con sulbactam.
Medio de cultivo= LB.
Resultados
Ensayo de expresión en otros medios de cultivo

Medio Mínimo Optimizado




Medio de Autoinducción
medio de cultivo
pellet bacteriano
centrifugación
lisis y centrifugación
pellet de lisis
fase soluble
Extracción con Vertrel XF
Cultivo bacteriano inducido
Cultivo concentrado 40 veces
En condiciones nativas
(Sivashanmugam A., et al., 2009)
(Sivashanmugam A., et al., 2009)
(Studier F.W., 2005)
Laboratorio de Inmunología y Virología
Universidad Nacional de Quilmes

(Sivashanmugam A., et al., 2009)
ELISA
E. coli
Logramos expresar la proteína VP6 de RVC humano en un sistema procariota.
Determinamos las condiciones óptimas para la expresión de la misma.
Optimizamos el tratamiento de las muestras para recuperar mayor cantidad de proteína en forma soluble.
Purificamos la proteína recombinante en su forma nativa, lo que la hace ideal para usarla como antígeno para la producción de anticuerpos.


Evaluamos el uso en cultivos bacterianos del sulbactam, un compuesto que inhibe indirectamente la degradación enzimática de la ampicilina.
E. coli
Fotografía de microscopía electrónica de partículas de rotavirus visualizadas por tinción negativa. (Attoui H., et al., 2012).
Representación de la partícula rotaviral de tres capas, con sus proteínas rotuladas. (Attoui H., et al., 2012).
Imagen de microscopía crio-electrónica reconstituida del corte de un virión con una resolución de 9,5 Å. Los componentes se encuentran coloreados de la siguiente manera: Proyecciones en forma de punta (VP4) en rojo, capa de VP7 en amarillo, capa de VP6 en azul y capa de VP2 en verde. (Attoui H., et al., 2012).
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para los cultivos inducidos a diferentes T°.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para los cultivos inducidos a diferentes concentraciones de IPTG
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para los cultivos inducidos de cada colonia.
Valores de concentración bacteriana para el cultivo suplementado con sulbactam y el cultivo sin suplementar.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para el cultivo suplementado con sulbactam y el cultivo sin suplementar.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 realizado para el cultivo en medio mínimo optimizado.
Valores concentración bacteriana y de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 para el cultivo en medio de autoinducción.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 para la fase soluble y pellet de lisis.
Valores de VR del ensayo de ELISA anti-VP6 para la fase soluble y pellet de lisis tratados con Vertrel XF.
44 Kda
44 Kda
Revelado del gel de poliacrilamida resuelto. L: Marcador de peso molecular. S: Fracción soluble que pasó por la columna. M: Volumen muerto. L60: Lavado con imidazol 60 mM en buffer de lavado. L90: Lavado con imidazol 90 mM en buffer de lavado. E1, E2, E3, E4, E5: Eluciones con buffer de elución.
Revelado del Western Blot realizado utilizando anticuerpos anti-His.
Rosana.

Graciela, Alejandro, Marcelo A., Mariana, Facundo, Alejandra, Laura, Marcelo M. y Florencia.

Silvia, Fernando y Mariano

Universidad Nacional de Quilmes.

A todos los presentes.
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