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INMUNOPRECIPITACIÓN

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by

Linda Arce

on 28 August 2013

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Transcript of INMUNOPRECIPITACIÓN

INMUNOPRECIPITACIÓN
Y
GENES REPORTEROS
Linda Alfonso-Luisa Osorio-Laura Pinzón-Alexandra Sandoval

¿En qué consiste?
La IP es un método de detección de complejos en una solución (ADN, ARN, proteínas), mediante la precipitación de la interacción de un anticuerpo con su blanco de unión específico.
Métodos
Directo Indirecto
IP y Co-IP
Anticuerpos pre-inmovilizados en un sustrato de fase sólida. Ej: perlas magneticas, perlas de agarosa.
¿Para qué?
Aislar y/o Concentrar una proteína/secuencia de interés de una mezcla
Inmunoprecipitación
Genes reporteros
Anticuerpos se añaden directamente a la mezcla. Posteriormente se añade proteína A/G.
Tipos
-ChIP -CO-PI -RIP -IP
Ip. Cromatina Ip. Complejos proteicos Ip. ARN Ip. Proteina individual
ChIP
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina
3. Preparación de la cromatina
5. Inversión de reticulación y ADN
1. Estabilización de complejos proteicos de DNA
2.Lisis celular
Formaldehido. Uniones covalentes grupos amino
Liberación de componentes celulares, disolución de la membrana celular, basado en detergentes.

4. Inmunoprecipitación
Anticuerpo adecuado
Complejo anticuerpo-proteína-ADN

Purificación

Liberación del DNA de la proteína a la que esta unido por acidificación
Aplicaciones
Bibliografía
7) Guillen, I., Lleonart, R., del Barco, D. G., Martinez, R., Herrera, F., Morales, A., ... & de la Fuente, J. (1996). Reporter genes for transgenic fish experiments.Biotecnologia Aplicada, 13(4).
8) Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., & Travi, B. (2004). Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime® and Pentostam®) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomedica, 24(4), 393-402.
9) Koo, J.; Kim, Y.; Kim, J.; Yeom, M.; Lee, I. C.; Nam, H. G. (2007). "A GUS/Luciferase Fusion Reporter for Plant Gene Trapping and for Assay of Promoter Activity with Luciferin-Dependent Control of the Reporter Protein Stability". Plant and Cell Physiology 48 (8): 1121–1131
10) Tjian R. (1995) Molecular machines that control genes. Scientific American 272:54-61.
Tsien R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67:509-544.
1)Collas, P. (2010). "The Current State of Chromatin Immunoprecipitation". Molecular Biotechnology 45 (1): 87–100.
2)Hayworth, D. (2013) . ChIP Assay Procedure and Essential Tools. Thermo Fisher Scientific Inc.
3) O'Neill, L .(2003). "Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP". Methods (San Diego, Calif.) 31 (1): 76–82. 
4 ) Voet, D., & Voet, J. G. (2006). Bioquímica. Madrid, etc: Editorial Médica Panamericana.
5) Bonifacino, J. S., Dell'Angelica, E. C. and Springer, T. A. 2001. Immunoprecipitation. Current Protocols in Molecular Biology. 10.16.1–10.16.29.
Rosenberg, Ian (2005). Protein analysis and purification: benchtop techniques. Springer. p. 520.
6) Crowell RE, Du Clos TW, Montoya G, Heaphy E, Mold C (November 1991). "C-reactive protein receptors on the human monocytic cell line U-937. Evidence for additional binding to Fc gamma RI". Journal of Immunology 147 (10): 3445–51.
Ventajas y Desventajas de las técnicas
Genes reporteros
Inmunoprecipitación
En la javeriana....
En la javeriana....
Western blot por SDS-PAGE
Agarosa vs Perlas magneticas
Trascripción
Traducción
7
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