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Seminario de Bioquímica

Un modelo de ratón con Aciduria Arginosuccinica
by

Amalia Fernandes

on 24 April 2014

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Transcript of Seminario de Bioquímica

Se produjeron ratónes homocigotos AL (-/-)
Aspectos generales de la AL:
-Es una enzima citosólica que funciona como un tetrámero.
-Participa en dos ciclos:
1. El ciclo de la urea: siendo la responsable de clivar el arginosuccinato en arginina y fumarato, el cual ingresa en el ciclo de Krebs.
2. El ciclo de la arginina – citrulina: proveyendo de arginina a dicho ciclo para generar NO y citrulina. Esta arginina endógena producida por AL es preferentemente utilizada para la síntesis de NO, que la arginina proveniente de la dieta.
-Aciduria arginosuccínica : es una enfermedad autosómica recesiva. Presenta síntomas de hiperamonemia.
Clivaje del gen de la AL
Tomaron un fragmento de ADN previamente aislado del genoma de ratón, a través de una
hibridación de placa
para aislar el gen de AL.
Usando
estrategias estándar de clonaje
, los exones 8 y 9 fueron remplazados por un caset de neomicina, el cual sirve para eliminar 2 de los 13 exones y generar ARNm comenzando en el exón 10.
Este gen de AL constituido, es electropodado hacia la célula embriológica indiferenciada. Los clones de estas células fueron identificados por
Southern blotting
, usando el procedimiento mini-southern.
Introducción:
Objetivos: Investigar la función de la enzima Argininosuccinato Liasa (AL).
Un modelo de ratón con Aciduria
Arginosuccínica

Seminario de Metabolismo

Explorar la patogénesis y posibles nuevos tratamientos
Funciones de la AL:
- Provee un camino para la eliminación de nitrógeno en exceso en mamíferos.
- Une el Ciclo de la Urea al Ciclo del TCA al generar fumarato.
- Es necesaria para la formación de arginina.
Deficiencia de la AL:
-Produce Aciduria Arginosuccinica.
Procedimiento
científico
Metodología
Clivaje del gen de la AL.
Se produjeron ratones homocigotos deficientes de AL.
Análisis de datos.
Medición de las concentraciones de guanidinoacetato y
creatina
Análisis de amoníaco en plasma.
Análisis bioquímico
Medición de la actividad de la AL.
Análisis de aminoácido sérico
Medición de los productos de degradación del NO y de los metabolitos relacionados.
Resumen
Ciclos
Ciclo de la arginina- citrulina
Ciclo de la Urea
Medición de la actividad de la AL.
Mediante un análisis colorimétrico de la producción de urea a partir de arginosuccionato.
Análisis de aminoácido sérico
Por cromatografía de líquidos de alta presión utilizando la reacción y detección de ninhidrina a 570nm.
Análisis de amoníaco en plasma.
Fueron medidos a través de la absorbancia, correlacionando una disminución de la absorbancia a 340nm (producida por la oxidación de NADPH) con la disminución de la concentración de amoníaco sérico.
Medición de las concentraciones de guanidinoacetato y creatina
Fueron medidas en extractos acuosos homogenizados de corazón, músculo esquelético e hígado usando espectrometría de masa en tándem.
Se generaron ratones heterocigotos para el alelo mutante y los reprodujeron para producir ratones homocigotos deficientes.
Análisis datos.
De muestras salvajes y mutantes.
Los genotipos de las crías indicaron que no hay un aumento de la letalidad en útero de los homocigotos nulos de AL (-/-) o lo ratones heterocigotos.
Al nacer presentan misma aparencia y peso.
Al termino de 48 hs los AL (-/-) mueren.
MUTANTES VS SALVAJES
ANÁLISIS DE GENOTIPADO POR PCR
En los ratones AL (-/-) hay una deficiencia completa de la actividad de la AL.
La cantidad enzimática de AL (-/-) es de 14-77 µmol/h/g mientras que en las muestras salvajes de AL es de 673-1540 µmol/h/g.
Se observó que el hígado de AL (-/-) posee niveles reducidos de la actividad de la arginasa,en comparación con la muestra control
Los ratones AL (-/-) poseen niveles elevados de arginosuccinato sérico, citrulina y glutamina y niveles bajos de arginina sérica en comparación con las crías de tipo salvaje.








Los ratones AL (-/-) tienen aumentos de los niveles de amoníaco en plasma en comparación con los ratones de tipo salvaje.
No se destacaron diferencias en la concentración de creatina y nitrito en muestras salvajes y mutadas
No hubieron diferencias en la concentración de GMPc en la orina de los ratones AL (-/-) en comparación con la orina de ratones de tipo salvaje.
La ausencia de variaciones a nivel de los AL (-/-) se debe principalmente a la edad joven de los ratones, así como la presencia de niveles residuales de la producción materna.
Medición de los productos de NO y metabolitos
Fue realizada en muestras de orina usando la reacción de Greiss
Los niveles de GMPc en orina e hígado homogenizado fueron medidos usando el Biotrak GMPc enzima en un inmunoensayo.
Las mediciones de GMPc en concentraciones de fentomoles /Well fueron llevadas a cabo por espectrofotometría medida en 450 nm.
Aciduria Arginosuccinica.
Desorden autosomal recesivo del metabolismo de nitrógeno que resulta de una deficiencia de la enzima AL.
Sintomatología: - presentes a temprana edad
- vómitos
- letargo
- retraso mental
- hiperamonemia
Consecuencias : -disfunción progresiva del hígado y fibrosis.
-cirrosis.
-alteración del flujo sanguíneo.
-reducción de la capacidad energética y síntesis de NO en el cerebro.
Resumen
El ciclo de la urea posee 2 funciones: la biosíntesis de arginina y la eliminación del exceso de nitrógeno.
La arginina endógena también es utilizada para la biosíntesis de creatina y NO.
Fundamentos bioquímicos: elevaciones de aminoácidos, acido arginosuccínico y citrulina y bajos niveles plasmáticos de arginina
Su disminución causa: -Menor concentración de NO: -Alteraciones en el flujo sanguíneo
-Modificaciones en la liberación de NT
(afectación del aprendizaje)
-Menor concetración de Creatina: -Afecta la capacidad energica del
cerebro y músculo esquelético.
Resultados del experimento
La deficiencia de AL causa Aciduria Arginosuccínica
y Nitrito
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