Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Primer Dizaynı Nasıl Yapılır?

No description
by

Begüm TERZİ

on 21 May 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Primer Dizaynı Nasıl Yapılır?

Genomik tekniklerin neredeyse tamamı, A=T ve G≡C bazları arasındaki fiziksel kuvvete, yani Hidrojen bağlarına dayanır.
Primer uzunluğunun
18-22 baz
arasında seçilmesi tesadüf değildir; amaç, bu her yere bağlanmaya çalışan DNA zincirlerinin sadece kendine özgü [specific] yerlere bağlanması için bir hesaplama sonucu karar verilen bir uzunluktur
.
Bir DNA zincirine karakteristik özelliklerini veren şey,
bazların dizilimi
.
DNA normal şartlar altında çift zincirli bir yapıda olmayı sever
ve bunun için elinden geleni yapar; tam da bu nedenle, eğer karşısında tam olarak bağlanabileceği ve kendi mıknatıs dizilim yapısına uygun başka bir zincir varsa bağlanmayı gerçekleştirerek çift zincirli yapıda kalır.
1) Primerin kendi içerisinde bir saç tokası [hairpin] şeklinde hibridize olması:
Eğer, primer dizinizin iki ucundaki mıknatıs dizilimi şekil olarak birbirini tamamlıyorsa ve bu dizi kıvrılabilecek kadar uzunsa, bu muhtemel bir durumdur.
3) Primerin, başka tür bir primerle uçlarından hibridize olması:
Bu kez de, aynı ortamda bulunan fakat dizilimleri farklı iki primeri (forward ve reverse primerler) düşünün; ilkinin dizilimi [5']TATAATC[3'], diğerininki ise [5']TATATAG[3'] olsun. Tahmin edeceğiniz üzere, bu iki primer de TATA uçlarından hibridize olabilirler ve sonuçta aşağıdaki şekil ortaya çıkar.
2) Primerin, yine aynı tür bir primerle uçlarından hibridize olması:
Bu kez bir primer kendi içerisinde değil de, yine aynı dizilime sahip başka bir primerle etkileşime geçebilir.
Yaklaşık 0.5 ºC'lik bir hassasiyetten bahsediyoruz. Bu Tm değerini etkileyen ilk faktör grubu, primerimizin baz içeriği ve dizilimi. İkinci faktör grubu ise, primerimizin içerisinde bulunduğu ortamın iyon konsantrasyonunu belirleyen çözünürler.
Tm değeri

Primer - taslak DNA bağlanmasını öyle bir dengede tutmalıyız ki, hem bu bağlanmalar kararlı bir şekilde ve büyük oranda oluşabilmeli, hem de özgün olmayan bağlanmalar engellenebilmeli.
Bu kritik sıcaklığa erime sıcaklığı [temperature of melting] veya İngilizce karşılığının baş harflerinden oluşan Tm adını veriyoruz.
Bir PCR deneyinin düzgün çalışması, Tm değerinin doğru ayarlanmasıyla doğrudan ilgilidir.
Primer Dizaynı
Primerlerin taslak DNA'daki hedef yerine kendi içerisinde bağlanma durumu PCR reaksiyonunu mahveden ve kesinlikle istemediğimiz bir durumdur.
Bir primer için
Tm

değerini
nasıl hassas bir şekilde hesaplayabiliriz?
Primer Dizaynı Nasıl Yapılır?
Eğer primer(ler)iniz, hedef bölgeye bağlanmak yerine, kendi içlerinde hibridize olmayı daha çok tercih ederlerse, DNA'yı çoğaltacak olan Taq Polimeraz enzimi hedef bölge yerine primerlerinizi çoğaltır, ya da çoğaltacak bir hedef bulamaz. Bu durumda ya PCR reaksiyonu hiç çalışmaz, ya da çalışır ancak sadece primer ikililerini [primer dimers] çoğaltır ve amacınıza ulaşamazsınız.
Önemli olan, deney tüpüne eklediğimiz her bir bileşenin Tm değeri üzerinde nasıl belirleyici bir etkisi olduğunu iyi anlamak ve hesaplamaları yaptırırken bilgileri doğru girmek.
Elimizde çok kısa bir primer dizisi olsun,
ATGCATGC
Bu primer dizisinin varsayılan [default] değerlerle ne kadarlık bir Tm değerine sahip olduğunu görmek için
IDT Oligo Analyzer
'a başvuracağız.
Bu DNA dizilimini ilgili kutucuğa yerleştirip Analyze linkine tıkladığımızda,
Tm değer 20.1 ºC
.
Na+
konsantrasyonuyla oynayalım ve bu değeri iki katına (100 mM) çıkaralım,
yeni Tm değerimiz 24.2!

Bu fark primer uzunluğu arttıkça artar;
halihazırda kullandığınız primerler için bu hesaplamayı yapın ve farkı görün!
Bir de
Taq polimeraz ile DNA arasında
yer alan fiziksel bağlar var ki, bunlar üzerinde de
Mg++
konsantrasyonu büyük ölçüde etkili. Özetle, magnezyum Taq polimerazın kofaktörü ve bu enzimin etkinliğini arttırıyor. Ancak aynı zamanda ortamdaki magnezyum konsantrasyonu fazla olduğunda da çift zincirli DNA'nın yeterince ayrılmamasına da neden olabiliyor. IDT Oligo Analyzer'da magnezyum konsantrasyonunu arttırdığınızda primeriniz için hesaplanan Tm değerinin büyük ölçüde arttığını göreceksiniz; aynı etki taslak DNA üzerinde de oluyor.
Primerin çalıştığımız genomda nerelere bağlanabileceğini nasıl bulabiliriz?
Primerin Taq Polimeraz'ın yerleştiği uçtaki yaklaşık 3 bazlık bağlanma tam olarak gerçekleştiği sürece, geri kalan kısımlardaki baz eşleşmelerinin bir kısmı tam olarak gerçekleşmese bile bu PCR reaksiyonu gerçekleşecek ve o DNA bölgesi çoğaltılacaktır. Somutlaştırayım: 20 bazlık bir primerin bazen yarısı (toplamda 10 baz) dahi tam olarak bağlanmasa bile reaksiyon verimi çok düşük olsa bile reaksiyon gerçekleşebilir. Eğer primerin tam olarak bağlandığı bölgeden bir ürün çıkıyorsa, diğer düşük verimli bölgelerden çıkacak ürün miktarını gölgeleyecektir.
Hesaplamalardoğrultusunda ortaya birçok alternatif primer çifti çıkabilir, genomdaki bazı istisnai bölgeler dışında çoğu zaman elimizde birden fazla alternatif olacaktır. Ancak, elimizdeki her bir primer genomda herhangi başka bir bölgeye bağlanabilir mi?



1) alternatif primer çiftlerinin hedef bölgeye uygun olacak şekilde bir yazılımla tasarlanması ve

2) bulunan alternatif primer çiftlerinin BLAST ile genomda nerelere bağlandığının tespit edilmesi.
İlk aşamayı gerçekleştireceğiniz birçok yazılım var ve ticari olmayanların -yani bedava olanların- en iyisi
Primer3
İkinci aşama içinse neredeyse tek alternatifiniz
NCBI
bünyesinde yer alan BLAST adlı araç.
TEŞEKKÜRLER
Begüm TERZİ
Leyla Nurefşan GÜNDÜZ
Primer Dizaynı
1)Primerin Özgüllüğü (Spesifitesi)
Dejenere primerler
Primerin GC içeriği
Primerin 3’ Ucu Stabilitesi
2)Primer Uzunluğu
3)Primerin Erime Sıcaklığı
4)Primerin Bağlanma Sıcaklığı
5)Tekrarlar

6)İkincil Yapılar

Primer Dizaynında Dikkat Edilmesi Gereken Özellikler
1.
Oligonükleotidin tek bir dizilime özgül olması gerekmektedir. Özgüllükte esas rolü oligonükleotidin 3’ucu oynar.
2.
Saç tokası oluşturmaması için oligonükleotid kendi içinde karşılıklı eşlenik baz dizileri içermemeli
3.
Oligonükleotid çiftleri dimer oluşumuna neden olacak şekilde birbirleri ile eşlenik olmamalı.

4.
Oligonükleotidlerin uzunluğu 18-24 baz arasında olmalı.



5.
Oligonükleotid çiftlerinin Tm’leri birbirine denk veya yakın olmalı.

6.
Oligonükleotid dizilimleri için 3’ten fazla tekrar eden baz olmamalı
Full transcript