Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Jel Filtrasyon ve İyon Değişim Kromatografisi

No description
by

eren tur

on 8 December 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Jel Filtrasyon ve İyon Değişim Kromatografisi

Kromatografinin Sınıflandırılması
Uygulama Biçimine Göre
- Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
- Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Süperkritik akışkan kromatografisi







Ayrılma Mekanizmalarına Göre

- Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi
- İyon değiştirme kromatografisi
- İyon çifti kromatografisi
- Afinite kromatografisi
- Dağılma kromatografisi

Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)
bitki pigmentleri
klorofil A, klorofil B, ksantofil ayrımı
Prensip:
Dolgu maddesinin porlarından daha
büyük moleküller, porlara girmeden
kolon boyunca ilerleyip çıkar.

Daha küçük moleküler büyüklüğe sahip olanlar ise; porların içerisine girer; ancak kolondan sürekli akış sayesinde tekrar pordan çıkar. Tüm kolonda bu şekilde hareket eder.

Kolondan, küçülen molekül büyüklüğüne doğru molekül çıkışı gözlenecektir.

Toplanan fraksiyonlarda da moleküler büyüklüğüne göre giderek daha küçük moleküller toplanacaktır.




Kolonun Dengelenmesi
*
Dengeleme tamponu, belirli hız & süre
kolondan geçirilir.

Jel filtrasyon Kromatografisi
Desorpsiyon
Bu aşamada adsorbe olan
bileşenlerin kolon dolgu materyalinden
ayrımı gerçekleştirilir.

Desorpsiyon için ortam koşulları, dolgu materyali ile örnek arasındaki bağın gücünü azaltacak yönde değiştirilerek ayrım gerçekleştirilir.

pH değeri ya da tuz derişimi gradienti, kolona tutulmuş maddelerin yavaş yavaş ayrımını sağlar.

Kolondan ayrılan proteinler ise
fraksiyonlarda toplanmaya başlar ve
dedektörden okunarak pik şeklinde
kendisini gösterir.
İyon Değişim Kromatografisi
Kromatografi
Jel Filtrasyon Kromatografisi
İyon Değişim Kromatografisi
Jel Filtrasyon ve İyon Değişim Kromatografisi

Karışımdaki maddelerin,
biri sabit diğeri hareketli faz olmak
üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı
bir sistemde

ayrılması
,
tanınması
ve

saflaştırılması

yöntemlerinin genel adıdır.


Sabit faz:

"katı" ; "katı destek üzerine emdirilmiş
sıvı tabakası"

Hareketli faz:

"sıvı", "gaz"


çözünürlük
adsorpsiyon
yüzey tutunma
Kolonda bileşenlerin yürütülerek geliştirdiği bu yönteme, renkli bantlar gözlemlediği için kromatografi adını vermiştir.
Faz Tiplerine Göre
- Sıvı kromatografisi
Sıvı-Katı
Sıvı-Sıvı
- Gaz kromatografisi
Gaz-Katı
Gaz-Sıvı
moleküler büyüklük
** **
duran faz:

polimer yuvalarına su emdirilip oluşturulan bir jel
hareketli faz:

sıvı çözelti
Elüsyon
Kromatografi işlemi ile, bir maddeyi,
durgun ve hareketli fazlar arasında adım adım yürüterek başka maddelerden ayırma işlemi
Elüat
Elüsyon işlemi sonunda toplanan çözelti
Fraksiyon
Elüsyon sonrası toplanan elüatın
her bir parçası

*
Kolonun dengelendiği, kolon çıkışındaki bir dedektör yardımıyla bilgisayar ekranından kontrol edilebilir.

*
Bunun dışında kolonun dengelendiği beslenen tampon molaritesiyle, kolondan çıkış molaritesinin karşılaştırılmasıyla da belirlenebilir.
Örnek Yüklemesi
ve Elüsyon
Örnek, küçük hacimde kolona yüklenir.

Hareketli faz kolondan geçirilmeye devam edilir.

Hareketli fazın akışı ile birlikte, örnek dolgulu kolon içerisinde ilerlerken, kolon porlarına girmeyen büyük moleküler elüsyondan
erken çıkacak.

Molekül büyüklüğü küçüldükçe kolonda
daha çok zaman geçiren moleküller
daha geç çıkacak.
Yıkama
Amaç, kolon koşullarını ilk haline döndürmek.

Tampon çözeltinin ve dolgu materyalleri arasında kalmış olabilecek moleküllerin uzaklaştırılması için kolondan belirli akış hızlarında su ve ardından etanol geçirilir.

Kolonun temizlendiğine,
*
kolon basıncından (önce düşer, sonra sabitlenir),
*
dedektör sinyallerinden (sabit sinyal)
*
görsel olarak (rengin açılması) karar verilir.

Her kullanım sonrası rutin temizliğin dışında, kolon ömrünün uzaması için uygun çözücülerle belli periyotlarda daha kapsamlı temizlikler yapılmalıdır.
Sonuçların Alınması
protein için

Bradford yöntemi ile protein tayini,
ardından elektroforez uygulaması, spesifik absorbans ölçümü...
enzim için

aktivite tayini, ardından Bradford yöntemi ile protein tayini, spesifik aktivite tayini, elektroforez uygulaması...
Jel Filtrasyon
Polimerleri

Sefadex
(ticari adı):

*
Çok fazla hidroksil grubu (-OH)
*
Suya ve polar çözeltilere afinitesi yüksek
*
Dextrandan elde edilen polimer
*
Kazanım değerine (KD) göre isimlendirilir.
(KD: kuru jelin ağırlığının, aldığı su miktarına oranı)


Agaroz jeli
:


*

Büyük molekülerin , bazı proteinlerin ve virüslerin ayrımında

*
Hidrofilik jeller

*
Sulu sistemlerde kullanılırlar.
Biojel
(ticari adı): 3 boyutlu poliakrilamid jel.
Jel Filtrasyon
Kromatografisinin Kullanım
Alanları

• Makromoleküller
• Virüsler
• Ribozomlar
• Hücre çekirdekleri
• Bakteriler
• Protein karışımları
• Enzim karışımları

!!!

Ayrılmak istenilen molekülün karakterine ve molekül büyüklüğüne
uygun polimler kullanılmalı
!!!


Amaç: T
ırpana balığından elde edilen kas proteini hidrolizatlarından (MPH) antioksidatif özellikteki peptidlerin izolasyonu, saflaştırılması tanımlanması

Saflaştırma yöntemi:
iyon değişim (IEC) - jel filtrasyon (GFC) - ters faz HPLC

Kolon: (IEC)
HiTrap CMFF
- (GFC)
26/60 sephacryl S-100HR


Tampon:

(IEC)
50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) linear gradient of NaCl (0e1.0 M)

(GFC)
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2)

Sonuç:
MHP den

elde edilen, antioksidan aktivitesi en yüksek hidrolizatlar saflaştırılmış ve gıdalarda kullanımının uygun olduğu görüşüne varılmış.



** katı faz iyonları- çözeltideki
moleküllerin iyonları arası ilgi **
Prensip:

Yüklü katı faza bağlı iyonlar ile örnekteki iyonlaşmış moleküllerin yer değiştirmesi; ve ardından ortam şartları değiştirilerek bağlanan moleküllerin kolondan sırayla ayrılması işlemine dayanır.

Kolona iyonlar bağlandıktan sonra örnek gönderilir ve bu iyonlar daha büyük bir bağ kuvvetine sahip iyonlar ile yer değiştirir.

Hareketli fazın pH ya da tuz konsantrasyonu gibi özellikler yavaşça değiştirilerek kolon dolgusu ile bağ yapan moleküllerin bağ kuvvetlerinin zayıflaması sağlanır.







Bağ kuvveti zayıfayan molekül dolgu materyalinden kopar ve kolondan çıkar.

Kolondan çıkan moleküller fraksiyonlarda toplanarak ayrımları gerçekleştirilir.
KAYNAKLAR
Başlangıç Koşullarının Dengelenmesi
Kolondan belirli pH değerine ve belirli iyonik güce sahip tampon/çözelti geçirilir.

Kolonun içerisindeki matriksinin sahip olduğundan ters yüklü çözelti geçirilerek, bu çözelti ile kolon matriksinin iyonik bağ yapması sağlanır.

Tüm kolon matriksi bağ yaptığı anda kolon dengeye gelmiştir ve artık örnek yüklemesine hazırdır.

Kolonun dengelendiği, kolon çıkışındaki bir dedektör yardımıyla bilgisayar ekranından kontrol edilebilir


!!! Önemli nokta, kolon matriksiyle düşük iyonik güce sahip bağların oluşumunu sağlamaktır.

!!!
Örnek Yüklemesi ve Adsorpsiyonu
Kolon dolgu materyali ile örnek arasındaki iyonik bağ kuvvetinin, çözücü içerisindeki iyonlarla yaptığından daha fazla olması gerekmektedir.

Örnek kolonda ilerlerken, iyonik bağ gücü yönünden daha kuvvetli olan iyonlar, dolgu materyaliyle bağ yapma eğilimine girer.

Bağlanmayan iyonlar ve dengeleme sırasında bağları kopmuş iyonlar kolondan ayrılır.
pH değeri kademeli değiştirilir.
İzoelektrik noktası gelen protein yüksüz hale geçer
iyonik bağ bozularak serbest hale geçer. Yerine çözücü içerisindeki iyonlar bağlanır.
Basamaklı elüsyon:


Kolondan proteinlerin elüsyonu sırasında değişik pH değerine sahip ve değişik iyonik şiddetli çözeltiler sırasıyla geçirilir. Ancak uzun zaman alır.

Gradiyentli elüsyon:


Kolon belli pH değerinde dengelenir. Örnek enjeksiyonu yapılır. Bu durumda proteinler kolona tutundurulur.

Ardından pH değeri ya da tuz konsantrasyonu farklı iki kaynaktan hareketli faz beslemesi yapılır. Besleme oranları zamanla değiştirilir.

Fraksiyonlama boyunca bu iki çözeltiden gradiyent elde edilecek şekilde cihaz ayarlanır.



Elüsyon İşlemi
Fraksiyonlama

Sonuçların Alınması
Yıkama
Kolon koşulları ilk haline döndürülür.

Bunun için başlangıçta dengeleme yapılan çözelti konsantrasyonu, iyonik denge, pH ya da tuz dengesi bakımından aynı çözelti kolondan geçirilir. Ardından su ve etanolle yıkama yapılır.

Kolonda kalmış olabilecek diğer bileşenlerin kolondan ayrılır ve kolon bir sonraki analize hazırlanmış olur.

Kolonun temizlendiğine,
*
kolon basıncından (önce düşer, sonra sabitlenir),

*

dedektör sinyallerinden (sabit sinyal)
*
görsel olarak (rengin açılması) karar verilir.

Uygun çözücülerle günlük yıkama yapılmadan kaldırmak kolon ömrünü azaltacağı gibi, ardışık analizlerde alınan sonuçların tutarsızlığına
neden olabilir.
Ayrılmak istenilen örnek, kimi zaman kolona hiç tutunmadan ayrılan bir madde, kimi zaman da gradiyentli kolon desorpsiyonu sonucu çıkan bir bileşen olabilir.
İyon Değişim
Reçineleri
Reçineler; polimere, asidik ya da bazik grupların bağlanmasıyla anyon ya da katyon değişim reçineleri
Anyon değişim reçinelerinde (-) değerlikli iyonlar (OH- ya da Cl- gibi); ayrılacak maddelerin anyonlarıyla yer değiştirirler
Katyon değişim reçinelerinde (+) değerlikli iyonlar ( H+ ya da Na+ gibi); ayrılacak maddelerin katyonlarıyla yer değiştirirler.

İyon Değişim
Kromatografisinin Kullanım Alanları
Amaç:

dragon meyvesinin kabuğundan amilaz enziminin elde edilmesi ve karakterizasyonu

Saflaştırma yöntemi:
GFC - IEC

Kolon:

(GFC)

Sephadex G-200

-


(IEC)

DEAE-Sephadex A50


Tampon: (GFC)
100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0 + 0.20 mM NaCl) -

(IEC)
100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)(gradients of 1%, 2%, 3%,
4% and 5% NaCl)

Sonuç:
Ca - independent, 70 derece gibi yüksek sıcaklıkta ve, 4-9 aralığı gibi geniş bir pH aralığında yüksek aktivite gösteren; şelatlayıcı ve okside edici ajanların varlığında bile kararlı olan, gıda endüstrisinde kullanım imkanı olan enzim saflaştırılmış.
• Su sertliğini giderme
• Karbonat giderme
• Deiyonizasyon
• Basit inorganik ve organik iyonların ayrımı
• Enzimlerin ayrımı
• İzoenzimlerin ayrımı
• Hormonların ayrımı
• İmmunoglobulinlerin ayrımı
• Nükleik asitlerin ayrımı
• Aminoasitlerin ayrımı
• Polipeptidlerin / polinükleotidlerin ayrımı
• Terapatik proteinlerin elde edilmesi

Amaç:
GFC ile pirinç samanından ksilooligosakkaritlerin(XOS) saflaştırılması

Saflaştırma yöntemi:
GFC

Kolon:
Superdex30

Hareketli faz:
deionized water

Sonuç:
Pirinç samanının hidrolizi ile oluşan degredasyon ile XOS yönünden zengin çözelti elde edilmiş ve GFC ile üç ana fraksiyona ayrılmış;
küçük polisakkaritler(PS) ve yüksek polimerizasyon derecesine (DP) sahip oligosakkaritler(OS)
;
düşük ve orta DP'ye sahip OS
;
di-monosakkaritler ve yan ürünler.
Bu yöntemle XOS eldesi yanında; selüloz ve ligninin içeriğince zengin kuru maddenin elde edilebilir olduğu kanaatine varılmış.

Saflaştırma yöntemi:
IEC, nötralizasyon, ultrafiltrasyon, vakum distilasyonu

Sonuç:
Ham gliserol, santrifüjleme gibi basit bir işlemle ayrılabilmesine sağmen, bu gliserol gıdalarda kullanılabilecek düzeyde saf olmadığı, tuzlardan, katalistlerden ve sabundan ayrılması gerektiği belirtilmiştir. kombine sistemler ile, farmasötik saflığa kadar gliserolün saflaştırılabileceği ve metanol, propanediol, gliseroltertbütileter gibi kimyasal üretiminde kullanılabileceği açıklanmıştır.

IEC burada anyonların ayrılması kısmında uygun olacağı belirtilmiştir. transesterifikasyon sırasında eklenen katalist kalıntıları, hem anyon hem de katyon dönüştürücü kullanılarak ortamdan uzaklaştırmanın uygun yöntem olduğu açıklanmıştır.
Amaç:
Bitkisel yağların transesterifikasyonuyla elde edilen biyodizelden, ham gliserolun ayrılması ve saflaştırılması için kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması
Amaç:

Anyon-EC ile yumurta sarısında bulunan ve emriyonun gelişimi için yüksek oranda metal iyonu içeren fosfoprotein olan fosvitinin saflaştırılması

Saflaştırma yöntemi:

Anyon-EC - GFC

Kolon:

(Anyon-EC)
HiPrep 16/10 Q FF anion exchange column

(GFC)
TSK-Gel G3000S 0,78*30 stainless column

Tampon:

(Anyon-EC)
(0.05 M Tris–HCl at pH 8.0
(GFC)
0.1 M sodium phosphate buffer (containing 0.2 M NaCl, pH 7.0)

Sonuç:

Posvitin, doğada bulunan en çok fosforillenmiş protein olup, gıda zenginleştirmek için kullanılabilirliği yüksektir. Anyon-EC sonrasında %97 lik bir verimle posvitinin elde edildiği ve geliştirdikleri metodun endüstriyel uygulamalar için uygun olacağı bildirilmiştir.
Yapılan çalışmalar
Kolon Özellikleri
!!!
kolon boyutları önemli
!!!
squat (kısa) kolon

-
uzunluk/çap oranı düşük
-
akış hızı yüksek
-
türbülans düşük

-
tamamen homojen örnek
uygulaması ve tampon akışını yakalamak zor
-
kararlılığı düşük
uzun kolon
-
uzunluk/çap oranı yüksek
-
lineer akış yakalanır
-
homojen örnek yüklemesi yapılabilir
-
kolonun tümünde aynı akış hızının yakalanır.
-
kararlılığı yüksek
-
ayırım daha fazla
çözeltinin kolondan akışı sırasında interaksiyona girdiği bead sayısı
20-40 kat
• Küfrevioğlu İ., Jel Filtrasyon Kromatografisi ve Iyon Değişim Kromatografisi İle Proteinlerin Saflaştırılması, Protein Kromatografisi ve Yeni Nesil Polimerik Sistemler, 2009, Ed: Denizli A., Küfrevioğlu İ., s: 257-265

• Aehle W., General Production Methods, Enzyme In Industry, 2007, Ed: Aehle W.

• • https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314823637792/litdoc11000421_20131003233016.pdf erişim tarihi: 21.11.2014

• http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/applications/ion-exchange-chromatography-iex/ erişim tarihi: 21.11.2014

• http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/applications/gel-filtration-gf/ erişim tarihi: 21.11.2014

• Ion Exchange Chromatography, Manual, Tosoh Bioscience

• Gel filtration Chromatography, Manual, Tosoh Bioscience

• ERCİYES ÜNİVERSİTESİ, Çevre Mühendisliği Bölümü, Çevre Kimyası Laboratuarı Dersi Föyü- I.Dönem, 2012

• Scopes, Robert K., Seperation by Adsorption, II. Specific Adsorbents, Protein Purification, Principles and Practice,1988, 2nd Edition, s: 107, 117, 119

• Scopes, Robert K., Seperation in Solutions, Protein Purification, Principles and Practice,1988, 2nd Edition, s: 194,195



Eren TUR
A13145646
Gıda Biyokimyasında Özel Konular
2014
Full transcript