Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

İmmün Ölçüm

No description
by

Hülya Çil

on 29 October 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of İmmün Ölçüm

İMMÜN ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ
İMMUNÖLÇÜM TEKNİKLERİ
1. RIA (Radyoaktive Immunassay)

2. EIA (Enzyme Immunassay)
ELISA (Enzyme Linked Immünosorbent Assay)
EMIT(Enzyme Multiplied Immünoassay Technique)
CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immünoassay)

3. Floroimmün Test

4. Kemiluminesans Immün Test

5. Elektrokemiluminesans Immün Test
Immünolojik teknikler
, antijen-antikor etkileşmesine dayanan analiz yöntemleridir.
Bu yöntemlerde bilinen bir antijen olduğunda örnek materyal içerisinde özgül antikor veya bilinen bir antikor olduğunda örnek materyal içerisinde özgül antijen saptanabilir. Ayrıca örnek materyal içerisindeki özgül antijen veya antikor miktarların niceliksel testlerle saptanabilir.
Antijen-antikor birleşmesinin özellikleri;
-Antijen-antikor birleşmesi spesifik bir olaydır. Fakat birbirine benzeyen gruplar arasında da birleşme olabilir. Buna
çapraz reaksiyon
adı verilir.
-Antijen-antikor birleşmesi kimyasal bir olaydır. Bu birleşmede kovalent olmayan bağlar rol oynar.
-Antijen ve antikor molekülü tam olarak reaksiyona girer ve birleşen moleküller parçalanmazlar
-Antijen-antikor birleşmesi reversibil bir olaydır.
-Antijen ve antikor multivalan olduklarından ve reaksiyon için bütün valansların doyması şart olmadığından değişik oranlarda birleşir.
Antijen-antikor birleşmesinde pH, tuz konsantrasyonu ve ısının da etkisi vardır

1
•Kalitatif yöntemler

-Presipitasyon
-Ring testi (halka deneyi)
-Tüpte sulandırma yöntemi
-Jelde presipitasyon (immünodifüzyon)
-Radyal immünodifüzyon
-Çift yönlüimmünodifüzyon
-Immünoelektroforez
-Flokülasyon
-Aglütinasyon
-Kompleman fiksasyon testi
Immünolojik teknikler
• Immunölçüm, hormon ölçümlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
• Günümüzde izotopik olamayan işaretleyiciler ile işaretli antikor (immunometrik) ölçümleri, özellikle peptid ve protein olmak üzere, birçok hormonu ölçmek için tercih edilmektedir.
2
•Kantitatif yöntemler

-Türbidimetrik ve nefelometrik ölçümler
-işaretlenmiş immünokimyasal ölçümler
-Radioimmunoassay(RIA)
-Enzyme immunoassay(EIA)
Presipitasyon:
Suda çözünen bir antijen ile spesifik antikorun karıştırılmasıyla suda çözünmeyen geniş antijen-antikor komplekslerinin meydana gelmesine
presipitasyon
ve çökeltiye
presipat
denir.
Bu test solüsyonda ve tüpte yapıldığında
presipitasyon testi
, agar jelde yapıldığında
jel presipitasyon testi
olarak adlandırılır.
Antijen veya antikor fazla olduğunda küçük ve genellikle solubl kompleksler meydana gelir; antijen-antikor oranları optimale yakın olduğunda ise geniş ve suda çözünmeyen kompleksler meydana gelir.
RIA, bağışıklık reaksiyonlarının spesifikliğini radyokimyasal yöntemlerle birleştiren bir analiz yöntemidir.
Radyoimmünoassay metodu ile hormon tayininde radyoaktif bir element olarak kullanılır.
En çok kullanılan element I^125 dir.
Kullanımı kolay
Emniyetli ve ucuzdur.
Enerjisi düşük, özel aktivitesi yüksektir.
Yarılanma ömrü 60 gündür.
Radyasyon riski en azdır.
I^125 gamma ışınları yayar. Bu ışınlar sayılarak hormon seviyesi ölçülür.
Bu ölçümlerde kullanılan ve gamma ışınlarını ölçen cihaza
gamma sayıcı
adı verilir.
RIA nın Prensibi:
Deney ortamında, ölçülmek istenen hormonu; antikoru, I^125 ile işaretli
hormon ve işaretsiz hormon konur. Hormonun antikoru kobay ve tavşanlar gibi deney hayvanlarından elde edilebilir. Işaretli hormon ise laboratuvar şartlarında invitro olarak hazırlanır. Antikor ile işaretli antijen kitte hazır olarak verilir. Çoğunlukla antikor kitle birlikte verilen plastik tüplere önceden bağlanmıştır. Bu kitlere
CoutACount
adı verilir. Yani gözle görülmediği halde plastik tüpün civarında ölçmek istediğimiz hormonun antikoru bulunur. Işaretsiz antijen hasta serumunda ölçmek istediğimiz hormondur.
Işaretli antijenle Ag* işaretsiz antijen Ag (serumundaki hormon) antikora bağlanmak için yarışırlar. Ortamda işaretsiz antijen ne kadar çoksa antikora bağlanması o kadar fazla olur.
Ag + Ab + Ag*
Ag*Ab + AgAb + Ag* + Ag
Deney sonucunda tüpteki sıvı kısım dökülür. Böylece Ag* ve Ag atılmış olur. Tüpte tüp cidarına bağlı olarak sadece Ag*Ab ve AgAb kalır. Bu kompleksteki I^125 in yaymış olduğu gamma ışınları GAMMA sayıcısında sayılır. Elde edilen sayım, serumdaki hormon miktarı ile ters orantılıdır.Çünkü serumdaki işaretsiz Ag miktarı arttıkça işaretli Ag nin antikorla yapacağı kompleks miktarı azalır. Rakamlar standart eğriden değerlendirilerek serumdaki hormon miktarı hesaplanır.
Ilk geliştirildiği dönemlerde bu test tekniği ile kullanılan işaretler I125 ,I131 ve H3 izotoplarıydı. Sonraki dönemlerde, Co57 gibi metallerin izotopları da kullanılmaya başlandı. RIA yönteminde sınırlı sayıdaki spesifik bağlayıcı antikor ile, örnekteki antijen ve sabit miktarda radyoaktif işaretli antijen yarışmalı bir reaksiyonla birleşir. Hem işaretsiz hem de radyoaktif işaretli antijen ,antikor tarafından bağlanır. Serbest kalan radyoaktif işaretli antijenler ölçüm öncesi ortamdan uzaklaştırılmalıdır. Radyoaktif işaretli antijen yüzdesi test edilen örnekteki işaretsiz antijen konsantrasyonuyla ters orantılıdır.
RIA ( Radyoimmunoassay )
Avantajları ve Dezavantajları:

• RIA’nın
avantajlarından
biri pikomolar konsantrasyonlarda antijen saptanmasında yeterli duyarlılıkta tayin sağlayan yüksek gama ışını yayan radyoizotop işaretin kullanılmasıdır.


Dezavantajları :
Radyoizotop işaretleri bir iki aylık kısa raf ömrüne sahip olması ve bunun atıkların atılmasında güçlüklere ve yüksek maliyete neden olmasıdır. Sonuçta radyoizotoplara maruz kalmanın tehlikesi göz önüne alınmalıdır.
Bu metodun,
ELISA ( Enzyme-linked immunosorbant assay )
EIA ( Enzyme immunoassay)
EMIT ( Enzyme-multiplied immunoassay ) gibi isimleri vardır.

Immün reaksiyonların saptanması ve niceliklerinin ölçülebilmesi için, enzimlerin katalitik özelliklerinin kullanıldığı test yöntemlerini içeren tekniktir. Bu tekniğin temel basamaklarını şöyle sıralayabiliriz:

1.) Enzim-Antikor ya da enzim-antijen komplekslerinin (konjugatlar), testi yapılan antijen yada antikor (ligandlar) ile reaksiyonu sağlanır.
2.) Reaksiyon ortamına enzimin substratı eklenir.
3.)Substratın azalması ya da ilgili ürünün çoğalması saptanarak, antijen-antikor reaksiyonunun niceliği hakkında bilgi edinilir
EIA (ENZIM IMMUNOASSAY)
Tekniğin prensibi;
RIA da olduğu gibi antijenle antikor arasındaki reaksiyona dayanır.
Işaretli antijenle işaretsiz antijen antikorla reaksiyona girmek için yarışırlar.
Işaretsiz antijen tayin etmek istediğimiz maddedir.
Işaretli antijenin hazırlanmasında RIA da radyoaktif madde, bunda ise işaretleyici olarak enzim kullanılır. Bunun için metoda
enzim immunoassay
adı verilmiştir.
Alkalen fosfotaz
ve
Horseradish peroksidaz
en çok kullanılan enzimlerdir.
Reaksiyonun tamamlanmasından sonra seperasyon (ayırma) işlemi yapılır ve ortama bir substrat ilave edilerek spektrofotometrik olarak enzim aktivitesi ölçülür.
Enzim aktivitesi ile tayin edilmek istenen medde arasındaki ilişkiden analit konsantrasyonu tayin edilir.
Antikor + analit + Enzim-analit
Antikor-analit + Antikor-Enzim-analit + analit + Enzim-analit
seperasyon (yıkama)
Antikor-analit + Antikor-Enzim-analit + substrat
Kimyasal reaksiyon
Kromojen
Spektrofotometrik ölçüm
RIA ya alternatif olarak geliştirilmiş bir metoddur.
Avantajları ve dezavantajları
Avantajları;
Reaktifler göreceli olarak ucuzdur ve uzun süre saklanabilir
Çok yönlü eşzamanlı teknikler geliştirilebilir
Malzemeler ucuzdur ve fazla miktarda elde edilebilirler, İşaretleme sırasında radyasyon tehlikeleri yoktur
Otomasyona adapte edilebilirler
Homojen EIA haptenler ve proteinler için geliştirilebilirler.
Dezavantajları;
Aktivitesinin ölçümü bazı izotopların aktivite ölçümünden daha komplekstir
Enzim aktivitesi plazma içeriklerinden etkilenebilir
Homojen tekniklerin sensitivitesi RIA kadar değildir
Büyük protein molekülleri için homojen EIA’ler geliştirilmiştir, fakat kompleks immünkimyasal reaktifler gerekmektedir.
ELISA(ENZIM LINKED IMMUNOABSORBENT ASSAY)
Klinik analizlerde çok sık kullanılan heterojen bir EIA tekniğidir.
Tekniğin basamaklarını şöyle sıralayabiliriz:
Reaksiyon bileşenlerinden biri, mikrotitre küveti, plastik boncuk ya da manyetik bir partikülün üzerine basitçe adsorbe ettirilir ya da kovalent olarak bağlanır.
En sık kullanılan haliyle, katı yüzeye tutturulan reaksiyon bileşenleri antikorlardır ve antijen ölçümü yapılır.
Sonra reaksiyon ortamına ölçümü yapılacak antijeni içeren örnek eklenir ve katı fazdaki antikorla birleşmesi sağlanır.
Reaksiyon ortamında yalnızca
katı faza tutunmuş Antikor-Antijen kompleksleri
nin kalmasını sağlamak için yıkama yapılmasından sonra, enzimle işaretlenmiş antikor ortama eklenir ve böylece
‘sandviç kompleksi
’ denilen,
Antikor- Antijen:Antikor Enzim kompleksi
oluşur.
Bu tekniğin “heterojen” olduğunu anlatacak şekilde, bağlanmamış antijen-antikor enzim komplekslerinin ortamdan uzaklaştırılması (bağlı olan ve olmayan işaretlerin birbirlerinden ayrıştırılması) için ikinci bir yıkama yapılır ve sonrasında da, enzimin substratı ortama eklenir.
Gelişen ürün miktarı ölçülerek, bununla doğru orantılı olan antijen miktarı hakkında niceliksel bilgi edinilir.

ELISA tekniği, antikor ölçümü için de kullanılabilir. Ancak bu durumda, katı faza tutturulan reaktan antijendir, ölçülecek antikor bu antijen üzerine yönlendirilir ve son olarak da, antikora karşı (örneğin Fc fragmanına karşı) geliştirilmiş ve işaretlenmiş“anti-antikor antikorları” ortama eklenir.
-Enzimin substratı ortama eklenir.
-Renkli ürün oluşumu end-point veya kinetik ölçümle izlenerek ölçülür.
-Renkli ürün oluşumu, işaretsiz ligandın (serumdaki antijen veya antikor) konsantrasyonu ile ters orantılıdır.
-Standart grafikten konsantrasyon belirlenir.
Kompetitif ELISA yöntemi
Kemilüminesans İmmün Testi
RIA nın prensibine benzer fakat burada işaretleyici madde olarak radyoizotop yerine reaksiyona girdiğinde ışık yayan madde ( kemilüminesan madde ) kullanılır.
Işık yoğunluğu LÜMINOMETRE adı verilen cihazlarda ölçülür.
RIA da oladuğu gibi satandart değerlerle karşılaştırılarak sonuçlar otomatik olarak hesaplanır.

Gamma sayıcılarla herçeşit kit kullanılabilirken lüminometreler genelde kite bağımlıdır. Her firmanın cihazı sadece kendi kitini okur.
Kemiluminesans, kimyasal bir reaksiyon sırasında oluşan ‘ışık’ saçılımına verilen isimdir.
Isoluminol ve akridinyum esterleri en önemli kemiluminesan maddelerdendir.
Isoluminol’ün bir katalist varlığında (örn: mikroperoksidaz) hidrojen peroksit tarafından oksidasyonu, 425 nm’ de rölatif olarak uzun yaşam süreli ışık yayılımına neden olur.
ECL (ELEKTROKEMİLÜMİNESANS)
Maddelerin bir platin elektrod yüzeyinde elektro kimyasal olarak oluşturdukları kemilüminesans reaksiyonlarına dayanır.

Bu metodda;
Ruthenyum(II) tris-bipyridyl (Ru (bgy)3 ^ +2) ile tripropylamin (TPA) arasındaki kemilüminesan etkileşim kullanılır.
(Ru (bgy)3 ^ +2), protein , hapten, peptid ve nükleik asitler gibi çeşitli biyolojik moleküllerle kolayca birleşen çok stabil tuzlar oluşturur.
Küçük molekül ağırlıklı ( yaklaşık 1000 dalton) olduğundan moleküller mobilitide anlamlı bir değişiklik yapmadan ve antijen-antikor etkileşimini değiştirmeden çok sayıda işaretleme yapılmasına imkan sağlar.
ECL de sinyal üretim mekanizması çok kompleks olmakla beraber immunoassay e uygulanması oldukça basittir.
Bu özelliği ile çok sayıda analitin tayininde kullanıldığı gibi otoanalizörlere de kolaylıkla uygulanabilmektedir.
Metod son derece hassas ve linearitesi çok yüksektir.
Kompetitif prensip;
T4, T3, FT4, FT3, E2, Progesteron, Testosteron, DHEA
S, Kortizol, Folat, Vitamin B12 analizlerinde uygulanmaktadır.



Sandwichprensip;
TSH, FSH, LH, I-hCG, Prolaktin, Total PSA, FreePSA, Insülin, PTH, AFP, CEA, CA 19- 9, CA 125-5, CA 15-3 analizlerinde uygulanmaktadır.
Fluoroimmunoassay (FIA) yöntemler,özgül antijen- antikor bağlanmasının gösterilmesinde bazı maddelerin fluoresans özelliklerinden yararlanılan immünokimyasal ölçüm teknikleridirler.
Time-resolved fluorescence immunoassay ve Fluorescence polarization immunoassay (FPIA) gibi çeşitli fluoroimmunoassay yöntemler vardır.
Fluoroimmunoassay(FIA)
Fluorescence polarization immunoassay (FPIA) homojen bir teknik olduğu halde Time-resolved fluorescence immunoassay heterojen tekniktir.
Abbott Axsym System’de, fluorescence polarization immunoassay (FPIA) yöntemi ve microparticle enzyme immunoassay (MEIA) yöntemi ile analiz yapılmaktadır.
Ring testi
,sıvıortamda yapılan presipitasyonun en basit formudur. Ince tüplere konulan sabit miktardaki antikor solüsyonu üzerine bir tabaka oluşturacak şekilde artan oranlarda antijen eklenir. Eğer temas yerinde halka şeklinde bir presipat oluşursa deney pozitifdir.

Tüpte sulandırma yöntemi
, optimal antijen-antikor oranını araştırmak için tüpte yapılan en eski yöntemdir. Bir sıra tüpe konulan belli miktardaki antikorun üzerine değişen miktarlarda suda çözünür antijen eklemesi yapılır. Uygun antijen ve antikorun bulunması halinde azdan başlayarak gittikçe artan ve sonra azalarak kaybolan bir bulanıklık görülür. Ilk tüplerde antikor fazlalığı, son tüpte ise antijen fazlalığı vardır; bulanıklığın en fazla olduğu tüpte ise antijen-antikor oranı birbirine denktir.
Jelde presipitasyonda (immünodifüzyon)
, presipitasyon reaksiyonları antijen ve antikor moleküllerinin birbirine doğru yayılabildiği jel veya yarı katı ortamlarda yapılır. Böyle bir ortamda birbirine doğru yayılan antijen ve antikor optimal oranda bulundukları bölgelerde karşılaştıklarında bir presipitasyon çizgisi veya bandı oluşturarak çökerler.
Jelde presipitasyon(immünodifüzyon)işlemiçeşitli şekillerde yapılmaktadır:

-Radyal immünodifüzyon(Mancinimetodu)
-Çift yönlü immünodifüzyon(Ouchterlonymetodu)
-Immunoelektroforez
-Zıt yönlü immünoelektroforez
-Laurell(Roket) immünoelektroforez
Radyal immünodifüzyonda(Mancinimetodu)
,bir antijen için monospesifik antikor agarla karıştırılır ve bir tabaka oluşturacak şekilde bir plağa dökülür. Daha sonra agarda çukurlar açılır ve açılan çukurlara ölçülecek antijen solüsyonu konur. Antijen çukurdan agarın içerisine yayılır ve bir presipat oluştuğunda çukurun çevresinde bir halka hal meydana gelir. Mancini, halkanın çapının karesi ile çukurdaki antijenin konsantrasyonu arasında doğru orantının olduğunu belirlemiştir. Standart eğri hazırlayarak kantitatif ölçüm de yapılabilir.
Çift yönlü immünodifüzyonda(Ouchterlony metodu)
,solubl antijen ve antikor molekülleri agar plağı üzerinde açılmış karşı çukurlara konur. Antijen ve antikor bu çukurlardan birbirlerine doğru agar içerisinde yayılırlar ve optimal konsantrasyonlarda karşılaştıklarında bir presipitasyon bandı veya çizgisi oluşur. Bu testte aynı seruma karşı teste tabi tutulan birçok antijenin birbirine yakınlığıda ortaya çıkarılabilir. Plağa dökülmüş agarın ortasına bir ve çevresine birkaç çukur açılır; ortadaki çukura antiserum ve çevredeki çukurlara antijenler konur.
Immunoelektroforez
, çift yönlü jel difüzyonunun hızlandırılmış şekilde yapılan modifikasyonudur. Bu sistemde agar, ince bir tabaka halinde lama yayılır ve agarda çukur açılır. Daha sonra bu çukura antijen eklenir ve lam bir elektrik alanına konur. Antijen molekülleri bu elektrik alanında hareket eder ve spesifik pH’da elektrik yüklerinin farklı olması sebebiyle birbirlerinden ayrılırlar. Elektroforezden sonra agardan hareket yönüne paralel olacak şekilde bantlar kesilip çıkarılır ve yerlerine antiserumlar doldurulur. Antiserumun yayılması için bir süre beklenir. Uygun antijen antikorla karşılaştığında presipitasyon bandı oluşur.
Zıt yönlü immünoelektroforez
, çabuk yapılan çift yönlü jel difüzyon deneyidir. Hazırlanıp lama yayılan agarın iki ucuna iki çukur açılır. Çukurun birine antijen, diğerine antiserum konur. Antikorun bulunduğu taraf pozitif kutba, antijenin bulunduğu taraf ise negatif kutba bağlanır. Negatif yüklü olan antijen antiseruma doğru, antikor ise elektroendozmozla antijene doğru hareket eder ve karşılaştıkları yerde bir presipitasyon bandı oluşur.
Laurell(Roket) immünoelektroforezde
, antikor içeren ve pH’ı antikorun hareketsiz antijenin negatif yüklü olmasını sağlayacak şekilde ayarlanmış agarda açılan çukurlara değişen konsantrasyonlarda antijen veya değişik antijenler eklenir. Elektriksel alan uygulandığında rokete benzer şekilde presipitasyon bandları oluşur. Oluşan presipitasyon bandlarının yüksekliği eklenen antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Standart eğri hazırlayarak kantitatif ölçüm de yapılabilir.
Flokülasyon
, toksin (antijen) ve antitoksin (antikor) arasındaki reaksiyonla tüpte yaygın bir bulanıklığın meydana gelmesidir. Flokülasyonda denge bölgesi çok dardır; bu bölge dışında prozon ve post zon olayları görülür.
Flokülasyon testinde
toksin (antijen) ve antitoksinden (antikor) biri sabit tutulurken diğeri sulandırılarak buna eklenir ve karışım 52oC’de tutulur. Tüpler sık sık kontrol edilir ve ilk bulanıklık görülen tüp flokülasyon titresini verir. Toksinin miktarı
Lf (flokülasyon sınırı birimi)
cinsinden ifade edilir. Bir Lf birimi, bir birim antitoksini en çabuk floküle eden toksin miktarıdır.
Aglütinasyon
Partiküler yapıdaki antijenin özgül antikor ile birleşmesi sonucu oluşan reaksiyona “
aglütinasyon reaksiyonu
” denir. Aglütinasyon reaksiyonunda rol oynayan antijenler, bakteri hücresi, eritrosit gibi partiküler özelliktedir.
Aglütinasyonun meydana gelmesi için bazı şartlar gerekir:

-Ortamda elektrolitler olmalıdır. Bu nedenle aglütinasyon testleri serum fizyolojikle yapılır.
-pH’ın nötral veya nötrale yakın olması gerekir.
-Isının önemi vardır; aglütinasyon optimal ısı derecesinde yapılmalıdır.
-Iyi bir aglütinasyon elde etmek için antijenin tuzlu suda iyi süspanse olması gerekir.
Aglütinasyon testleri için
, bazı çözünür antijenler inert yapıdaki lateks, polystren veya bentonit gibi partiküler hale getirilmiş taşıyıcı maddeler üzerine bağlanırlar. Bazı antijenler taze veya formalin ile işlem görmüş eritrosit yüzeyine direkt olarak bağlanabilmektedir. Sıvı ortamda karıştırılan partiküler yapıdaki antijen ile özgül antikorun (aglütinan antikor) homojen görünümü zamanla çıplak gözle görülebilen kümeleşme haline dönüşür. Partiküler antijen olarak eritrositin kullanıldığı aglütinasyon testlerine
hemaglütinasyon testleri
denir.
Aglütinasyon testleri mikroskopta, tüpte, lamda yapılabilir. Aglütinan antikorlar genel olarak IgM ve IgG karakterinde antikorlardır.
Antijen–antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir.
-Özgül antikor varlığı araştırılan serum örneğinin tüplerde ½ oranında azalan seri dilüsyonları yapılır.
-Serum dilüsyonu yapılmış tüplerin her birine eşit miktarda antijen eklenir.

Eklenen antijenle serum örneğindeki antikor (var ise) birleşerek immün kompleks oluşur. Belirli bir titreden sonra immün kompleks oluşmaz veya yeterli düzeyde oluşmaz.
Kompleman fiksasyon testi
-Serum titrasyonu yapılmış ve antijen eklenmiş olan tüplerin her birine eşit miktarda
kompleman
eklenir. Eklenen kompleman immün kompleks oluşmuş tüplerde aktive olur ve tüketilir (antijen-antikor kompleksine bağlanır). Belirli bir tüpten sonra dilüsyon nedeniyle serumdaki antikor miktarının azalmasına bağlı olarak eklenen kompleman tüketilemez.
-Bütün tüplere indikatör hücreler (anti-eritrosit antikor kaplı eritrositler) eklenir. Immün kompleks aracılığı ile tüplere eklenen kompleman tüketilmiş ise eklenen indikatör hücrelerde parçalanma olmaz zamanla tüpün dibine çökerler.
-Tüplerde antijen-antikor kompleksi aracılığı ile tüketilmemiş kompleman kalmış ise kalan aktif kompleman miktarı ile ilişkili olarak indikatör hücrelerin tamamında veya bir kısmında lizis (hemoliz) olur.
-Hemoliz olan ilk tüpten bir önceki tüpteki serum titrasyonu antikor miktarını tanımlamak için kullanılır.

Immünotürbidimetrik ve immünonefelometrik ölçümler
Antijen-antikor bağlanması ile oluşan immün kompleks süspansiyonunu içeren küvete gönderilen monokromatik ışığın hem absorbe edilmesi hem de defleksiyona (sapmaya) uğratılması özelliğinden yararlanılan ölçümlerdir.

Türbidimetrik yöntemde
,immün kompleks tarafından absorbe edilen ışık miktarı spektrofotometrik olarak ölçülür.
Nefelometrik yöntemde,
immünkompleksler tarafından defleksiyona uğratılan ışık miktarı orijinal ışık kaynağına belirli açılarda yerleştirilmiş olan dedektörler ile ölçülür.
Hem türbidimetrik yöntemde hem nefelometrik yöntemde absorbe edilen veya defleksiyona uğratılan ışık miktarı, sıvı ortamdaki immün kompleks miktarı ile doğru orantılıdır. Standart eğri hazırlayarak antijen veya antikorun kantitatif ölçümü yapılır.
Işaretlenmiş immünokimyasal ölçümler, genel olarak
kompetitif
veya
nonkompetitif
ve
heterojen
veya
homojen
olarak sınıflandırılabilir.
Kompetitif reaksiyonlar
, genellikle işaretlenmiş antijen kullanır ve aşırı antijen varlığında antijen ölçümü için yapılır. Bir adımda uygulanan yöntemde bütün reaktifler aynı zamanda karıştırılır, iki adımda uygulanan yöntemde belli zaman sırasıyla karıştırılır.Analit ve işaretlenmiş analit, antikor üzerindeki bağlanma yeri için yarışırlar.
Nonkompetitif ölçümler
, genellikle işaretlenmiş bir antikor kullanılarak ve aşırı antikor varlığında antijen ölçümü için yapılır. Plastik bir tane veya test tüpü gibi bir solid faza bağlı antikor ve çözeltide işaretlenmiş antikor içeren ikinci faz vardır.
Heterojen ölçümlerde
,serbest işaretli antijeni (Ag*) bağlı işaretli antijenden (AbAg*) ayırmak için fiziksel ayırma teknikleri gerekir.
Homojen ölçümlerde
, serbest işaretli antijeni (Ag*) bağlı işaretli antijenden (AbAg*) ayırmak için fiziksel ayırma teknikleri gerekli değildir; antikor bağlanmasıyla antijenin işaretinin aktivitesi modüle edilir ve modülasyonun büyüklüğü ölçülen antikor veya antijen konsantrasyonu ile orantılıdır.
Radyoimmünoassay(RIA), Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) ve Time-resolved fluorescenceimmunoassay,
heterojen immünokimyasal ölçüm teknikleridirler.

Fluorescence polarization immunoassay(FPIA),Enzyme- multiplied immunoassay(EMIT) ve cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA),
homojen immünokimyasal ölçüm teknikleridirler
.
Heterojen, nonkompetitiv, işaretlenmiş antikorlu immünokimyasal teknikler
Bu tekniklerin ilk basamağında bir solid fazda immobilize edilmiş antikorlar kullanılır.
Antikorlar, polystyrene microtiter plate, latex veya ferromagnetik partiküllerde immobilize edilebilirler.
Ikinci basamakta, immobilize antikorla serum örneğinde ölçülmek istenen antijen bağlanır; antikor-antijen kompleksi oluşur.
Yıkama ile antikor-antijen kompleksi dışındaki maddeler ortamdan uzaklaştırılır.
Üçüncü basamakta, işaretlenmiş ikinci bir antikor*solid fazda immobilize antikora bağlanmış olan antijene (antikor-antijen kompleksine) bağlanarak sandwich formu (antikor-antijen-antikor*) oluşturur.
Yıkama ile antikor-antijen- antikor* kompleksi dışındaki maddeler ortamdan uzaklaştırılır.
Dördüncü basamakta, işaretlenmiş ikinci antikor*un işareti enzim ise, uygun kofaktörle birlikte substrat eklenir ve oluşan ürünün miktarı renk (ELISA’da), fluorescence (FIA’da) veya ışık (chemiluminescence immunoassay’de) olarak ölçülür.
Bu basamakta oluşan ürünün miktarı, test örneğindeki antijenin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Serumda bulunan allerjen antijene özgül antikorların (spesifik IgE antikoru) ölçülmesi için geliştirilen RAST testinde solid fazda immobilize test antijenleri ve enzimle işaretlenmiş anti-immünoglobulinler kullanılmaktadır.

Heterojen, kompetitiv, işaretlenmiş antikorlu immünokimyasal teknikler
Bu tekniklerin ilk basamağında bir solid fazda immobilize edilmiş antikorlar kullanılır.
Antikorlar, polystyrene microtiter plate, latex veya ferromagnetik partiküllerde immobilize edilebilirler.
Ikinci basamakta, immobilize antikorla bağlanmak için serum örneğinde ölçülmek istenen antijen ve işaretli antijen*yarışır; antikor-antijen ve antikor-antijen* kompleksleri oluşur. Yıkama ile antikor-antijen ve antikor-antijen*kompleksleri dışındaki maddeler ortamdan uzaklaştırılır.
Üçüncü basamakta, işaretlenmiş antijen*nin işareti enzim ise, uygun kofaktörle birlikte substrat eklenir ve oluşan ürünün miktarı renk (ELISA’da), fluorescence (FIA’da) veya ışık (chemiluminescence immunoassay’de) olarak ölçülür. Bu basamakta oluşan ürünün miktarı, test örneğindeki antijenin konsantrasyonu ile ters orantılıdır.
Kalitatif Yöntemler
Full transcript