Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Untitled Prezi

No description
by

Gökhan Hatipoğlu

on 26 November 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Untitled Prezi

1- Giriş ve Teorik Bilgi
2- Problemin Tanımı
3- Çalışmanın Amacı
4- Deneysel Yöntem
5- Sonuçlar
6- Tartışma
7- Kaynaklar
İÇERİK
DESELÜLERİZE ECM’LERDE İMMÜNOJENİK KALINTI MİKTARLARININ OTOFAJİ YOLAKLARI KULLANILARAK AZALTILABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI
Deselülerizasyon
; fiziksel ya da kimyasal yöntemler ile dokudan hücresel içeriğin uzaklaştırılması ve yalnızca Ekstraselüler Matriksin elde edilmesi prosesidir. [3]
Giriş ve Teorik Bilgi
(giriş)
Deselülerize ekstraselüler matriksler:
yaralar, kesikler, uzuv kayıpları, yanıklar, kanser, organ yetmezliği, diyabet kaynaklı doku kayıpları gibi disfonksiyonların tedavisinde
Rejenerasyonu sağlamak amacıyla
Deselülerize tam organ matrikslerinde yeniden hücre ekilerek fonksiyonel organ geliştirilmesinde uygulanmaktadır.
Problemin Tanımı
Doku İzolasyonu
Doku Kültürü
Deselülerizasyon
DNA Sayımı ve Histokimya
Dokuların Homojenizasyonu ve Ekstraksiyonu
İmmünizasyon
Doğrudan Bağlantı ELISA
Metod

Otofaji;
hücre içi makro moleküllerin ve organellerin bir kesecik içine alınarak lizozomlara yönlendirilmesi ve lizozomla birleşerek burada parçalanmasına yol açan bir mekanizmadır.
Doku kültürü;
dokuların ve hücrelerin canlının dışında (ex vivo) sıvı, yarı-katı veya katı besiyeri kullanılarak yetiştirilmesi.
Deselülerizasyon işlemi, ilk uygulamalarında ksenotransplantların immün yanıt potansiyellerini düşürerek daha kullanılabilir hale getirmek amacıyla kullanılmaktaydı;
fakat aynı zamanda proses sonrasında matriks içerisinde iyileşme sırasında ortama progenitör hücre göçü, ortamda damarlanma, büyüme ve farklılaşma sağlayacak bir miktar biyolojik sinyal molekülünün de kaldığı anlaşılmış bulunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
Projemizin birincil amacı deselülerize ECM’lerin yaygın medikal kullanımının sağlanabilmesi için öncelikli olarak aşması gereken immün cevap sorunun üstesinden gelmek için yenilikçi bir yöntem geliştirmektir.
Bu proje sayesinde, literatüre doku mühendisliği ve deselülerizasyon alanında tümüyle yeni bir bakış açısı kazandıracak çalışmalara bir temel atılmış olacaktır.
Bunları yaparken kullanılacak yöntem literatürde daha önce hiç bahsedilmemiş ve matriks üretiminde daha önce hiç denenmemiş özgün bir metodu kapsamaktadır.
Deneysel Yöntem
1- Farelerden Doku İzolasyonu
Ketamin, ksilazin anestezi altında farelerin ince bağırsaklarının (~35cm) ileum (sondan ~22cm) bölgesi aseptik olarak izole edildi ve dikdörtgen şeklinde 1,5cm’lik parçalara bölündü. Alınan örnekler %1 Antibiyotik-antimikotik solüsyon içeren HBSS (Hücre izotonik taşıma ortamı) ile yıkandı.[8,10] Soğuk aküde HBSS içerisinde kültür laboratuvarına taşındı.
2- Dokuların Kültürü ve Ön-İşlem
Tekrar HBSS ile yıkanan örnekler %1 Antibiyotik-Antimikotik solüsyon, %0,5 Gentamicin, %0 Glikoz içeren DMEM içerisinde 37°C sıcaklıkta, %5 CO₂, %95 hava ortam şartları altında petri kabında 48 saat ve petri başına 8 parça olmak üzere kültür edildi. [10] negatif kontrol grubu için ise aynı şartlarda ekstra olarak medium %0,45 Glikoz içermektedir. 24 saatte bir mediumun yarısı yenilendi.
3- Deselülerizasyon
Doku örnekleri %70 etanol ile dezenfekte edildikten ve serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra %1 Triton X-100, %0.5 Sodium Deoxycholate karışımı içeren deselülerizasyon solventi içerisinde 30-48 saat kapaklı erlende 36 parçaya 100 ml solüsyon eklendi ve orbital-shaker üzerinde çalkalanarak hücrelerden arındırıldı.[6,8]
4- DNA Sayımı
Hiçbir işleme uğramamış, sadece deselülerizasyon uygulanmış ve hem ön-işlem hem deselülerizasyon uygulanmış dokulardan DNA sayımı yapmak için kesit alınacaktır. DNA sayımında DAPI boyama kullanılacaktır.[8] İmmünofloresans mikroskopta alınan görüntüler bilgisayarda ImageJ yazılımı yardımıyla sayılacaktır. % deselülerizasyon oranı bulunacaktır.
5- Doğrudan Bağlantı ELISA
Deselülerize ECM ekstraktları 96-kuyu PS plakalara 0.05 M karbonat/bikorbonat pH 9.6 tampon çözeltisi kullanılarak 24 saat oda sıcaklığında sabitlenecektir. Seyreltilmiş serum ve ikincil antikor standart protokoller kullanılarak antijene bağlanacaktır. Plakalar, 15 dakika renklenmeye bırakılacak ardından spektrofotometrede absorbans değerleri okunacaktır.[6,13]
48 saat kültürü yapılan doku örnekleri A48 önadını alarak 48 ve 24 saatlik deselülerizasyon işleminden geçirildi(A4824). Bununla birlikte ön-işlem uygulanmadan doğrudan 24 saat deselülerize edilen dokular (N24) da negatif kontrol grubu olarak kullanıldı. Örneklerin eş kütleli lizatları BCA Assay total protein incelemesine tabi tutuldu.
Dokuların Homojenizasyonu ve Ekstraksiyonu
10056023 Miray Tayfun
11056012 Arda Deniz Dokuzoğlu

(Giriş)
Danışman: Prof. Dr. Adil Allahverdiyev
Normal dokudaki çekirdek sayısı/Deselülerize dokudaki çekirdek sayısı
X 100 = %Deselülerizasyon Derecesi
DNA Sayımı
Sonuçlar ve Tartışma
Deselülerize ECM’ler sıvı azotla dondurulup seramik havanda parçalanır (Mortar-Pestle).
Elde edilen dECM toz modifiye RIPA çözeltisi içerisinde (500mg:1,5ml) ekstrakte edilir.
14.000rpm 30dk santrifüjde çöktürülür 2 kez tekrarlanır. Süpernatant alınır.
Protein konsantrasyonu, BCA Assay Kit kullanılarak ölçülür.
Ek olarak 280nm UV spektroskopide 20 kat seyreltilerek total protein miktarı tahmin edilir.[6]
İmmünizasyon
Ekstraktlar erişkin farelere,
1. gün 25-35 ug CFA (Complete Freund Adjuvant) ile birlikte
4., 8., 11., 14. günler 20 ug IFA (Incomplete Freund Adjuvant) ile birlikte
enjekte edilecektir.
17. gün İmmünize edilen farelerin kuyruk veninden kan alınıp serumu ayrıştırılarak analizlerde kullanılmak üzere saklanacaktır.[6,13]
Operasyon Protokolü
- Sıçan sakrifiye edildi.
- Sıçan, elleri ve ayaklarından (çok gergin olmayacak şekilde) iğnelerle çalışma tahtasına sabitlendi.
- Karın ve tüyler alkolle ıslatılıp deriye yapıştırıldı.
- Karın derisi, pens ile kaldırılıp 45olik açı ile makasla kesildi.
- V şeklinde sağ ve sol çaprazlara kesikler atıldı bu sırada makas ile bağ doku kesilerek peritomdan ayrıldı.
- Peritom %0,9 NaCl ile yıkandı.
- Sadece peritom görülecek şekilde ameliyat örtüsü yerleştirildi.
- Kas doku ve peritom kesilerek açıldı.
- İç organlar görünür hale getirildikten sonra karaciğer bulundu.
- Karaciğer, kanatılmadan altından mide bulundu.
- Mide, pankreas ve duedenumun birleştiği noktadan hafifçe çekilerek dışarı alındı.
- Duedenumdan başlayarak, ince bağırsak bir pens yardımıyla yukarı çekilir ve başka bir pens yardımıyla omentum ve pankreastan ayrılır. (Bu ayırma işlemi ine bağırsağa en yakın noktadan ve ince bağırsağın çekilme yönünün tersi yönünde, sürekli ve kesintisiz bir şekilde yapılmalıdır.)
- Bir noktada ince bağırsak takılır ve çekmeye direnç gösterir. Bu nokta ince bağırsak, çekum ve pankreasın üçlü birleştiği noktadır. Bu aşamaya gelindiğinde içeride kalan bu nokta tespit edilir ve pens yardımıyla üçünü birleştiren omentum yırtılır. Bu aşamadan sonra işleme olduğu gibi devam edilir.
- Çalışılan masa üzerinde önceden hazırlanmış bir petride serum fizyolojik bulundurulur. Organ çekildikçe serum fizyolojik içeren petri içerisine bırakılır.
- Serum fizyolojik içerisindeki bağırsak dokusu bir ucundan makas ile kesilirken diğer ucundan bir pens ile çekerek lateral olarak açılır; pens ile yarı sıkıştırılarak serum fizyolojik ile dışkı ve mukoza temizlenir.
- Bağırsak 4-6 kere HBSS içerisinde yıkanır.
- Temizlenen bağırsak 1,5 cm’lik işaretli petride makas ve pens yardımıyla 1,5 cm’lik fragmentlere ayrıldı ve yıkama prosesi için HBSS dolu petri içerisine alındı.
- Bağırsak fragmentleri 5 kere tekrarlanmak üzere, HBSS içerisinde yıkandı ve sterilize edildi.
- Yıkanan dokular nakil için pens ile HBSS dolu falkonlara aktarıldı ve ağızları parafilm ile sarıldı.
- Falkonlar soğuk akü içerisine yerleştirildi.
- Bütün işlemler buz üzerinde yapılır.
48 saat kültürde kalan -DMEM High Glu. %5CO2, 37°C- başarısız olmuş, 12 saat içinde maya kolonizasyonu, pH ve renk değişimi gözlenmiştir. Grup deney dışı bırakılmıştır.
Açlık ortamında (DMEM w/o Glu, pyruvate, Phenol %5 CO2, 37°C) kolonizasyon, pH ve renk değişimi, makromorfolojik değişim ve nekroz gözlenmemiştir.
Dokular kontaminasyon gözlenmeden 72 saat boyunca kültür edilebilmiştir.
İnce bağırsak dokuları üzerinde bulundurduğu bağ doku miktarına bağlı olarak mediumda yüzme özelliği gösterir.
Yağ içeriği yüksek, petri kabında kültürü oldukça kolaydır.
Petrideki mediumun yüzey gerilimi ve dokunun yüzme özelliği sayesinde doku statik kültürde rahatça beslenebilmiş ve oksijen ihtiyacını karşılayabilmiştir. Kalınığı da kültüre uygundur.
Veriler
Veriler
N24
A4896
A4848
Çalışma kapsamında literatürde daha önce başarılamamış veya bahsedilmemiş olan erişkin sıçan/fare ince bağırsak organoid/doku kültürü yeni bir yöntemle denenmiştir.
ELISA sonuçlarına bakarak bu iki grubun arasında anlamlı bir antikor cevabı farkı olmadığını söylemek mümkündür. Bunun anlamı, deselülerize doku lizatlarının eş kütlelerinin içeriklerinin immünojenik olarak benzer karakterde olduğudur. Yani uygulanan ön işlem, protein ekspresyon desenini değiştirdiyse de dokunun antijenik karakterine olumlu veya olumsuz diyebileceğimiz bir şekilde etki etmemiştir.
UV ölçümlerle ilgili ilk sıkıntı çözgen olarak kullanılan RIPA’nın absorbans vermesidir.Bunun üstesinden gelmek için ölçüm çok düşük konsantrasyonlarda gerçekleştirilmiştir. Elde edilen UV absorbans verileri tutarsız sonuçlar vermesi sebebiyle rapora alınmamış, bu yöntem yerine kantitatif bir total protein tayini yöntemi olan BCA Assay Kit kullanılmıştır. .
İmmünizasyon sürecinde hayvanların davranışları ve patolojik inceleme sonuçlarındaki farklılığa rağmen ELISA’da ortaya çıkmamış olan antikor cevabı farkı ilk bakışta kafa karıştırıcı görünmektedir. Ancak belirtilmesi gereken bir takım detaylar bulunmaktadır. Lizatları hazırlamak için kullanılan RIPA buffer proteinden ayrılmadan enjeksiyona kadar proteinle birlikte kullanılır. Her ne kadar seyreltilse de çalışma gereği SDS ve NaDeoxycholate içeriği yüksek olan modified RIPA vücut için toksik ve tahrip edicidir. Doğal olarak protein içeriği daha düşük olan N24 enjeksiyonlarının seyreltmelerinde daha çok lizat kullanılmıştır.
BCA Assay

1.Jenerasyon 2. Jenerasyon 3.Jenerasyon

Lizat Tipi A4824 N24 A4824 N24 A4824 N24

Lizat Protein 3.109 2,176 2.524 2.254 2.304 1.614
Konsantrasyonu
mg/ml

Doku kesitlerinde yapılan DAPI boyama ile çekirdek sayımı (DNA sayımı) sonucunda elde edilen görüntülerin inspesifik bağlanması sebebiyle, DNA sayımı ve deselülerizasyon derecesi Haematoxylin boyalı çekirdek sayımıyla gerçekleştirilmiştir. Doku üzerinde eş büyütmede birim alana düşen çekirdek sayısı karşılaştırılarak %DNA yoğunluğu hesaplanmıştır. Deneysel yöntem bölümünde bahsedilen formül yardımıyla protokolün standart deselülerizasyon derecesi %98,7 olarak belirlenmiştir.

Eş alanda, eş büyütmede, haematoxylin çekirdek sayımı. İşlem uygulanmamış doku (yukarıda), deselülerizasyon sonrası doku (aşağıda).
Lizat haline getirilen dokular “protein içerikleri kütlece eşit olacak biçimde PBS ile seyreltilerek” eş hacimde, hacimce 1:1 oranda Freund’s Adjuvant ile karıştırılarak farelere i.p. enjekte edilmiştir. Fareler düzenli olarak takip edilmiş ve davranışları, sağlık durumları kontrol edilmiştir. ELISA için kanların toplanmasının ardından, fareler patolojik inceleme için disekte edilmiş ve kapsamlı olarak incelenmiştir. İmmünizasyon sürecinde kontrol grupları normal davranışlar sergilerken N24 grubu hareketsizlik, kümelenme, sık uyku, tüylerin matlaşması gibi hastalık belirtileri göstermekte, A4824 grubundaki farelerin N24’e göre daha hareketli ve aktif olduğu açıkça farkedilmekteydi.
ELİSA
Yapılan ELISA testi sonuçlarında deselülerize dokularda yalnız adjuvant alan fare grubuna göre önemli ölçüde fazla immün cevap gözlenmiştir. Ancak beklenilenin aksine işlem uygulanan ve yalnız deselülerize olan doku örnekleri arasında anlamlı bir antikor cevabı farkı gözlenmemiştir. A4824 grubu toplam ortalama 0.1715, N24 grubu toplam ortalama 0.1993, kontrol grubu ise toplam ortalama 0,054 birim absorbans vermiştir.

N24 grubu dalakta büyüme ve yağlanma (solda), diyafram-karaciğer yapışması ve akcğer altı enflamasyonu(sağda).
Kontrol grubu sağlıklı iç organlar(solda), alt-dış periton yüzeyindeemilmemiş adjuvant kalıntıları (sağda).
N24 grubu periton enjeksiyon bölgelerinde ciddi enflamasyon.

A4824 grubu akciğer altı enflamasyonu ve sağlıklı dalak, iç-organlar (solda); sağlıklı bir periton yüzeyi (sağda).

SON SÖZ
Tüm hayvan çalışmaları Tübitak HADYEK tarafından onaylanmış ve veteriner gözetimi altında yapılmıştır. Proje TÜBİTAK 2209/A programı kapsamında desteklenmekte ve finanse edilmektedir.
Öncelikle danışmanımız Prof. Dr. Adil Allahverdiyev, laboratuvarda emeği geçen Aslı Pınar Zorba ve Hilal Toptaş, Gülnaz Yıldırım ,Emrah Şefik Abamor, bize destek olan Prof.Dr.Dilek Balık ve emeği geçen diğer herkese teşekkürlerimizi borç biliriz.

KAYNAKLAR
⦁ Vorotnikova E, McIntosh D, Dewilde A, Zhang J, Reing JE, Zhang L, et al. Extracellular matrixderived products
modulate endothelial and progenitor cell migration and proliferation in vitro and stimulate regenerative healing in vivo. Matrix Biol. 2010; 29(8):690–700. [PubMed: 20797438]

⦁ Barkan D, Green JE, Chambers AF. Extracellular matrix: a gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. 2010; 46(7):1181–1188. [PubMed: 20304630]

⦁ Nelson CM, Bissell MJ. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 2006; 22:287–309. [PubMed: 16824016]

⦁ Taylor KR, Gallo RL. Glycosaminoglycans and their proteoglycans: host-associated molecular patterns for initiation and modulation of inflammation. FASEB J. 2006; 20(1):9–22. [PubMed: 16394262]

⦁ Nagase H, Visse R, Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovasc Res. 2006; 69(3):562–573. [PubMed: 16405877]

⦁ Werner S, Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev.2003; 83(3):835–870. [PubMed: 12843410]

⦁ Bornstein P, Sage EH. Matricellular proteins: extracellular modulators of cell function. Curr OpinCell Biol. 2002; 14(5):608–616. [PubMed: 12231357]

⦁ Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM, Netoff TI, et al. Perfusiondecellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 2008; 14(2):213–221. [PubMed: 18193059]

⦁ Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, Izamis ML, Guzzardi MA, Shulman C, et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 2010; 16(7):814–820. [PubMed: 20543851]
Full transcript