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Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Posgrad

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on 16 February 2016

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Transcript of Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Posgrad

Diabetes Mellitus Tipo 1
IDF. (2013, Nov). "Five questions on the IDF Diabetes Atlas." Diabetes Res Clin Pract 2013/12/03. Retrieved 2, 102
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Posgrado

Título de Tesis
Expresión de microRNA - 22 y microRNA- 150 en células mononucleares periféricas de pacientes con Diabetes Mellitus Tipo 1 y su relación con la autoinmunidad y características clínicas de la enfermedad.
miRNAs
IDF. (2013, Nov). "Five questions on the IDF Diabetes Atlas." Diabetes Res Clin Pract 2013/12/03. Retrieved 2, 102
Guay, C. and R. Regazzi (2013). "Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus." Nat Rev Endocrinol 9(9): 513-521.
Stankov, K., D. Benc, et al. (2013). "Genetic and epigenetic factors in etiology of diabetes mellitus type 1." Pediatrics 132(6): 1112-1122
miRNA- 22
miRNA-150
“Los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 presentan un patrón de expresión aumentado de miR-22 y miR-150 el cual se asocia a una mayor frecuencia de marcadores relacionados con autoinmunidad y características clínicas agresivas en los pacientes con DM1”.
Hipótesis
Objetivos Generales
• Establecer una relación entre los niveles de expresión de miR-22 y miR-150 con marcadores de autoinmunidad en pacientes con DM1.


• Analizar la posible asociación entre la expresión de miR-22 y miR-150 con características clínicas agresivas en pacientes con DM1.

Objetivos Específicos
Determinar el perfil de autoinmunidad cuantificando los anticuerpos Anti-GAD65, Anti-IA-2 y Anti-ZnT8 en suero de pacientes con DM1 y controles.

Estimar la expresión diferencial de miR-22 y miR 150 en CMPs de pacientes con DM1 y pacientes controles bajo estímulos basales, 11mM y 25 mM de glucosa.

Sujetos y Métodos
Análisis Estadísticos
Los participantes de este estudio fueron 20 pacientes con DM1 localizados en la Región Metropolitana de Santiago con un rango de edad que oscila entre los 4 a 19 años, las muestras fueron recolectadas en el Instituto de Investigación Materno Infantil (IDIMI) del Hospital San Borja Arriarán.
Extracción de Sangre
Resultados
Leucemia donde se detectó una disminución de la expresión sugiriendo que la regulación en la expresión de miR-150 es necesaria para el desarrollo de células T y B (Lu, Getz et al. 2005).
microRNAs y DM1
miRNA-22
Enfermedades Tiroideas Autoinmunes

Donde los niveles séricos se encontraron aumentados (Yamada, Itoh et al. 2014).
Esclerosis Múltiple sobre expresado en el plasma de pacientes. (Siegel, Mackenzie et al. 2012).
miRNA -150
Miastemia Gravis

Los niveles séricos de este microRNA se encontraron aumentados (Tanel, Rozen et al. 2013).
miR-22
Tabla 2. Características Clínicas grupo de pacientes DM1
Anti-dehidrogenasa del ácido glutámico (GAD)
Antitirosina fosfatasa (IA-2)
Transportador de Zinc 8 (ZnT8)

Auto anticuerpos DM1
Altamente expresado en células
pancreáticas humanas (Sun et al. 2008).
La sobre expresión de microRNA 22 puede promover la apoptosis de células acinares pancreáticas (Qin et al. 2014).

Relacionado con la Tumorogénesis
Desarrollo y Metástasis de Cáncer de mama (Song and Pandolfi 2013).
miRNA-22
Sobre expresión de miRNA-22 reduce los niveles endógenos del ER .

Resultando en la represión de la señalización de estrógeno la cual es requerida para la diferenciación de células T (Pandey and Picard 2009).
miRNA-22
La señalización a través ER podría estar asociado con efectos regulatorios inmunes caracterizados por una fuerte inhibición auto antígeno especifica de linfocitos T (Lelu et al. 2011).
Involucrado en el desarrollo y diferenciación de linfocitos T y B (Iborra, Bernuzzi et al. 2012) .
Bloquear el desarrollo de las formas inmaduras de células B (Zhou, Wang et al. 2007).
miRNA- 150
miRNA-150
Cuadro Clínico del Debut DM1
Clásica
Hiperglicemia : Triada clásica


Cetoacidosis Diabética
Hiperglicemia
Cetonemia /cetonuria
Acidosis metabólica

Silente
Tabla 1. Estudios de microRNAs en DM1
Guay, C. and R. Regazzi (2013). "Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus." Nat Rev Endocrinol 9(9): 513-521.
Separación por Gradiente de Ficoll
Cultivo a distintas concentraciones de glucosa por 20 h.
Síntesis de cDNA a partir de microRNAs
qPCR mediante Sondas TaqMan
10 ml
Reportado en estudios de DM2 donde se encontrado sobreexpresado (Karolina, Tavintharan et al. 2012).
Receptor de estrógeno alfa (ER ).
3 ´ UTR
Adenocarninoma de Pancreas
Bajos niveles de expresión de este microRNA tasas
de mortalidad altas (Yang, He et al. 2014).
En todos los casos se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Se utilizó el paquete estadístico Graphpad Prism v6.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, EEUU).
Cabe destacar que miRNA-22 no ha sido reportado hasta el momento en DM1.
El grupo control fue conformado por 20 personas sanas cuyo rango de edad oscila entre los 20 a 45 años para descartar la presencia de enfermedad, fueron excluidos de este grupo las personas con antecedentes personales y familiares de DM1 y otras enfermedades autoinmunes.
Extracción de RNA total (TRIZOL)
Los datos se representaron como media y error estándar de la media, y fueron analizados con estadística paramétrica, utilizando el test de ANOVA de dos vías seguido de posthoc de Sidak.
Discusión
Determinación de Auto-Anticuerpos
Evaluación de la expresión de miRNAs
miR-22
miR-150
Relación entre screening de auto-anticuerpos y perfil de expresión de miRNAs.
GAD65
IA2
ZnT8
miR-22
Relación entre screening de auto-anticuerpos y perfil de expresión de miRNAs.
miR-150
GAD
IA2
ZnT8
miR-150
miR-22
Relación entre el perfil de expresión de miRNAs y características clínicas de la enfermedad.
miR-22
miR-150
Evaluación de la expresión de microRNAs
Los linfocitos Th17 están relacionados con la patogénesis y severidad de varias enfermedades autoinmunes (Selmi et al. 2012)
miR-22 ER



Fuerte inhibición auto antígeno especifica de linfocitos T (Th), incluyendo Th1 y Th17 (Lelu et al. 2011).
miR-150 esta expresado en células B y T maduras pero no en sus progenitores.
La sobre expresión de miR-150 en células madre hematopoyéticas bloquea el desarrollo de células B en sus etapas tempranas al inhibir la transición del estado celular pro-B a el pre-B . (Zhou et al. 2007).
Relación entre perfil de auto-anticuerpos y perfil de expresión de miRNAs.
Relación entre el perfil de expresión de miRNAs y características clínicas de la enfermedad.
El grupo de pacientes Sin Cetoacidosis mostro un aumento en su expresión, y este efecto se observó con mayor impacto en la condición basal de glucosa para miR-22 y en la condición de 11mM de glucosa para miR-150.
miR-150
Realizó un análisis serológico para los autoanticuerpos GAD-65 e IA2 se observó una alta frecuencia (70%) para ambos anticuerpos, resultado esperable de acuerdo a lo registrado en la literatura (Kulmala, Savola et al. 1998).
Determinación de Auto anticuerpos
Discusión
ZnT8 frecuencia de 55% y su importancia radica en que ha sido relacionado en la detección de personas con bajo riesgo genético de desarrollar la enfermedad.
Este estudio es parte del proyecto Fondecyt 1130240 y fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile y por Hospital San Borja Arriarán, Instituto de Investigación Materno Infantil (IDIMI).
Tabla 3. Porcentaje de Anticuerpos Positivos en suero de Pacientes y Controles
No se encontraron diferencias significativas en los grupos de pacientes analizados.
van Belle TL, Coppieters KT, von Herrath MG. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiological reviews. 2011;91(1):79-118.
La expresión de miR 22 no varío excepto en la condición basal (sin insulto de glucosa) donde los pacientes presentaron una mayor expresión.

Esto se podría explicar especulando que son células de pacientes que ya vienen con un marcaje epigenético donde miR-22 podría desempeñar alguna función.
Se ha señalado que la expresión de varios microRNAs puede verse alterada o ser susceptible de cambio dependiendo de la concentración de glucosa a la que hayan sido sometidos . (Moura J. 2014)

Expresión de miR 21 esta usualmente incrementada en pacientes diabéticos, y este aumento de expresión se debe a altos niveles de glucosa en sangre. (Zeng et al. 2013)

miR 326 ha sido encontrado incrementado en Linfocitos de Sangre Periférica de pacientes con enfermedades autoinmunes entre ellas DM1 . (Du et al. 2009)(Sebastiani et al. 2012)

Se ha encontrado aumentado en cardiomiopatía diabética que es una de complicaciones macrovasculares mas severas. (Rawal et al. 2014)

miR-22
miR-22 podría actuar como regulador en la hipertrofia de cardiomiocitos y en el remodelamiento cardíaco teniendo como blancos Sirt-1 y Hdac-4. (Huang et al. 2013)

microRNAs (miR-150, miR-181, miR-146a) han revelado un patrón expresión alterado en varias patologías autoinmunes en donde están directa o indirectamente relacionados con la función o desarrollo de células T.
Estudios en modelos animales han determinado que la regulación de la respuesta hacia un componente Th1 conlleva la aparición de la enfermedad en DM1. (Rabinovitch et al. 1998)

Las citoquinas producidas por estos linfocitos Th1 (IFNg , TNF- , IL-2 y IL-12) se relacionan con la insulitis destructiva.

Se ha demostrado que el efecto protector de los estrógenos en varias patologías autoinmunes depende de la presencia de un ER intacto. (Whitacre et al. 1999)
Se conoce que mir-22 tiene la capacidad de desorganizar epigenéticamente la célula ya que actúa como un microRNA proto-oncogénico, además tiene la capacidad de antagonizar a miR-200 un microRNA antimetastásico. (Song 2013)

La expresión de miR-200 y su familia se han encontrado relacionadas con varias complicaciones diabéticas en donde han presentado diferentes patrones de expresión.(Moura et al. 2014 )(McArthur et al. 2011)

La expresión de miR-150 varío en la condición de 11mM que fue la concentración que utilizamos para simular el cuadro de un paciente expuesto a una hiperglicemia moderada leve.


La menor expresión de miR-150 nos podría indicar que a diferencia de otros microRNAs la hiperglicemia se relacionaría con los bajos niveles de expresión en CMPs de pacientes con DM1.

miR-150


Notch3 durante la diferenciación de Linfocitos T (cd4+,cd8+) (Ghisi et al. 2011).
miR-150 controla la activación normal de células T al actuar sobre Myb un factor de transcripción que controla múltiples pasos del desarrollo de Linfocitos. (Xiao et al. 2007)
Myb está altamente expresado en células pro-B y pre-B. (Thomas et al. 2005)
Estudios en animales con genes Myb o FOXP1 deletados muestran defectos graves en el desarrollo de células B. (Thomas et al. 2005)

El perfil de auto-anticuerpos fue comparado con la expresión de miRNAs (miR22 y miR150) y nuestros resultados no encontraron una relación entre estas variables.

Es decir los valores de la expresión de miRNAs son independientes del perfil de auto-anticuerpos para DM1.
Sin embargo, se observó cierta tendencia en la expresión de miR-22 al analizar el anticuerpo ZnT8 en el grupo de pacientes positivos para este anticuerpo lo que podría indicar que este autoanticuerpo frecuentemente asociado al grupo de pacientes con bajo riesgo de desarrollar la enfermedad mantiene cierta relación con la expresión de mir-22.

Otro de los genes importantes en el desarrollo de células B es Foxp1 que junto con PAX5, guían el reordenamiento del gen IgH que está altamente expresado en células pro-B y pre-B (Hu et al. 2006)
Evaluación de la expresión de microRNAs
Al analizar los datos encontramos que existe cierta asociación entre la mayor positividad de uno de los autoanticuerpo (anti-ZnT8) y el grupo de pacientes sin cetoacidosis al evaluar la expresión de miR-22 en la condición basal de glucosa, lo que nos hace suponer que este microRNA se expresa mas en pacientes con menor riesgo genético de desarrollar la enfermedad y que presentan un debut clínico clásico.
Relación entre el perfil de expresión de miRNAs y características clínicas de la enfermedad.
Línea de tiempo del proceso autoinmune que se desarrolla en la DM1
Otra característica clínica que se analizó fue la glicemia al momento del debut (glicemia alta o glicemia baja). La expresión relativa de miR-22 y miR-150 en pacientes no fue significativa en ninguna condición con respecto a la glicemia de debut
Para el análisis estadístico primero se normalizó las muestras tanto de pacientes como de controles mediante el método de ddCt, diseñado para analizar resultados de qPCR y permitir comparar la totalidad de los resultados, es decir los Ct de pacientes, controles y controles endógenos.
Si bien no se encontró diferencias al analizar estas variables se marca una tendencia que se repite en la expresión de miR-22 hacia una mayor expresión.
miR-150
A pesar de que no se encontró diferencias en la expresión de miR-150 y autoanticuerpos, hay cierta tendencia a una mayor expresión en la condición de 11mM de glucosa que se repite al comparar miR-150.

Lo que nos indica que este microRNA presenta un patrón de expresión que puede variar cuando es sometido a una concentración de glucosa .
Conclusiones
Estos resultados contrastan con la hipótesis planteada en la que esperábamos encontrar una relación de mayor expresión de ambos microRNAs en el grupo de pacientes DM1 que presentan características clínicas agresivas.
La expresión de miR 22 no varío excepto en la condición basal (sin insulto de glucosa) donde los pacientes presentaron una mayor expresión. Por otro lado miR-150 presento una mayor expresión en la condición de 11 mM, mostrando sensibilidad a los cambios de glucosa.
Se observo cierta relación entre la expresión de miR-22 al analizar el grupo de pacientes positivos para el anticuerpo ZnT8 lo que nos hace pensar que este microRNA podría estar relacionado con la expresión de ZnT8.
Con respecto a características clínicas los pacientes Sin Cetoacidosis mostraron un aumento en su expresión, en la condición basal de glucosa para miR-22 y en la condición de 11mM de glucosa para miR-150.
32 microRNAs están localizados en la misma región genómica y podrían actuar sobre el RNAm de los autoantígenos en DM1 y que 12 de estos microRNAs son sensibles a cambios de glucosa.(Abuhatzira et al. 2015).

Abuhatzira L, Xu H, Tahhan G, Boulougoura A, Schaffer AA, Notkins AL. Multiple microRNAs within the 14q32 cluster target the mRNAs of major type 1 diabetes autoantigens IA-2, IA-2beta, and GAD65. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2015. Epub 2015/07/08.
Poco se conoce acerca de cómo ocurre la regulación de la expresión de los autoantígenos en DM1.

Estudios recientes demuestran que los microRNAs están envueltos en la regulación de la expresión de los principales autoantígenos en DM1.

Otros microRNAs que responden a situaciones de hiperglicemia se han identificado tal es el caso de miR-195 el cual esta sobre expresado y podía ser responsable del daño tisular en retinopatía diabética.(Mortuza et al. 2014)

miR-210 un microRNA relacionado con úlcera diabética muestra cambios en su expresión bajo condiciones altas de glucosa en células endoteliales cultivadas en vitro. (Greco et al. 2012)
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