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Secuenciación Next Gen. ion torrent, illumina, SOLid

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by

Grace Iglesias

on 29 July 2014

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Transcript of Secuenciación Next Gen. ion torrent, illumina, SOLid

La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T)
Secuenciación Next Gen, ion torrent, illumina, SOLid
La elevada demanda de secuenciación de bajo costo ha dado lugar a las distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, produciendo miles o millones a la vez. Son las llamadas también secuenciaciones de nueva generación o "next-generation sequencing
Illumina (Solexa)
La segunda tecnología de secuenciación masiva que salió al mercado (2006)
Aquí se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes.
Secuenciación por ligación (SOLid).
La "secuenciación por ligación" ("SOLiD sequencing") es otro método que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa.
Este método utiliza un reservorio de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posición secuenciada, por su secuencia específica produce una señal correspondiente a la secuencia complementaria.
Ion Torrent semiconductor
Pirosecuenciación
El primer método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS), fue publicado en 2005 en Nature.
Se trata de un método escalable, un sistema de secuenciación altamente paralelizable con un rendimiento significativamente mayor que los instrumentos de electroforesis capilar.
El método consiste en 4 pasos:
1. Fragmentación del ADN (o ARN).
2. Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos.
3. Amplificación clonal (mediante PCR en emulsión).
4. Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en un soporte sólido y en escala de picolitros.
El proceso de secuenciación es realmente innovador, dándose distintas rondas de hibridación y ligado con 16 dinucleótidos marcados con 4 colores distintos. Empleando un código de colores, cada posición es evaluada dos veces lo que aumenta drásticamente la discriminación entre errores de secuencia y polimorfismos de SNPs.
Ya que los métodos de detección molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciación de una sola molécula, la mayoría utilizan un paso con clonación in vitro.
Los pasos consisten en la fragmentación del ADN y ligación de adaptadores. Luego hay un paso de amplificación es en una superficie sólida: “flow cell”, dónde luego se da la reacción de secuenciación)
La exactitud que ha alcanzado el secuenciador en febrero de 2011 era de un 99.6% basada en lecturas de 50 bases, con 100Mb por cada ronda.
Existen algunas limitaciones, por ejemplo si hay más de una base idéntica seguida en la cadena molde, se añadirán más dNTPs.
Otra limitación sería la longitud de los fragmentos de ADN que se estudian. Éstos no pueden pasar de las 400 pares de bases.
Uno de los métodos es la PCR de emulsión, en la que se aislan las moléculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa.
Las hebras de ADN y los primers se pegan a un portaobjetos, y se lleva a cabo una amplificación por la polimerasa, de forma que se crean colonias locales de ADN o "clusters de ADN".
Una cámara recoge la fluorescencia etiquetada de los nucleótidos, y determinará qué nucleótido es el que se ha unido en esa posición.
Se basa en la detección de iones de hidrógeno que se generan durante la polimerización del ADN. Posee micro-pocillos en los que se insertan la cadena de ADN a secuenciar, y se inunda con un único tipo de nucleótido, produciendose la liberación de un pirofosfato y una carga positiva en forma de iones de hidrógeno.

Si el nucleótido es complementario a la cadena de ADN, se incorporará, provocando la liberación de un ión hidrógeno, cuya señal será recogido por un sensor de tipo ISFET.
CONCLUSIONES:
Los métodos denominados de nueva generación a diferencia de los más antiguos como el método de Sanger, han logrado desarrollar una secuenciación efectiva a bajo costo, generando un aporte importante científico; pero así mismo requieren de equipos mas sofisticados.
Uno de los inconvenientes en el método de secuenciación SOLid, es que si se presenta repeticiones de bases se agregan más dNTPs, generando un porcentaje de error que no es detectable con exactitud.
La PCR de emulsión es uno de los métodos de detección molecular más utilizados junto con la clonación in vitro para aislar moléculas de ADN individuales y generar muchas copias de cada molécula.
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