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Hibridación de ácidos Nucleicos: fundamento y métodos de ens

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Mariana Sánchez

on 9 June 2014

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Transcript of Hibridación de ácidos Nucleicos: fundamento y métodos de ens

Es la Renaturalización de dos cadenas sencillas de ADN previamente desnaturalizado


Desnaturalizado
Enfriar previamente la solución del DNA desnaturalizado.
La sensibilidad de apareamiento entre bases complementarias presentes en cadenas sencillas.
Desnaturalización y Renaturalización del ADN.
Ácidos nucleicos : Se desnaturalizan por agentes físicos o químicos.

La desnaturalización consiste:

En la ruptura de los puentes de hidrogeno entre pares de bases
Interacciones hidrofóbicas entre bases apiladas

Estructuras de doble hebra de gran estabilidad

Pueden ser Híbridos:
DNA-DNA (homodúplex)
RNA-RNA
DNA-RNA (heterodúplex)

Influencia sobre la viscosidad
La relativa rigidez de la doble hélice y su inmensa longitud en relación al diámetro hacen que las disoluciones de DNA de doble hebra sean muy viscosas.
Significado práctico de las curvas de desnaturalización
Bajo condiciones definidas cada DNA muestra una curva de fusión con valores característicos de Tm y de magnitud del efecto hipercrómico.

La relación Tm y el contenido de bases C=G y A=T del DNA

Influencia sobre la absorción ultravioleta
Bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos poseen valores máximos de absorción de luz, cercanos a 260nm.

Efecto hipocrómico
La magnitud de la absorción no es la misma, pues el apilamiento y los puentes de hidrógeno la reducen.

Efecto hipercrómico
La desnaturalización del DNA va acompañada de un incremento en la A260
Las cadenas de acido nucleico hibriden entre si , indica que los organismos de donde proceden comparten un grado de herencia evolutiva en común, y que sus RNAs y proteínas tienen estructuras y funciones similares.

Estabilidad del hibrido: mas elevada sea la base complementarias mayor de la longitud de las secuencias apareadas.

Hibridación
Influencia sobre la desnaturalización sobre las propiedades del DNA
Análisis molecular de la hibridación de ácidos Nucleicos
Hibridación de ácidos Nucleicos: fundamento y métodos de ensayo
Integrantes:
Aguirre Moreno María José
Baldenegro Sánchez Emmanuel
Casillas Álvarez Jahely
Sánchez Mejía Mariana
Santana Cruz Andrea
Valenzuela Platas Mavi Axel


Posteriormente Las 2 hebras de DNA se separan
y se conforman al azar (no se altera la estructura primaria)

No se rompen los enlaces covalentes.

EN LOS ARNs

La desnaturalizacion afecta a:
tRNAs y rRNAs

AGENTES DESNATURALIZANTES
TEMPERATURA
ÁCIDOS BASES
AGENTES QUÍMICOS
TEMPERATURA
El apareamiento de bases disminuye por los Valores pH alejados de la neutralidad.

El medio ácido rompe la estructura primaria de los ácidos nucleicos.
Condiciones alcalinas.
Neutralización del medio-->Renaturalización.

ÁCIDOS Y BASES
AGENTES QUÍMICOS
Moléculas sencillas altamente polares con Grupos amino y carbonilo.

Estos les permiten competir en la formación de enlaces hidrógeno con los grupos amino y carbonilo de sus bases.

La renaturalizacion depende de la complementariedad de secuencias de las hebras.

Si se parte de una mezcla desnaturalizada de moléculas distintas de DNA, pero con secuencias parecidas en parte, al renaturalizar se puede producir la asociación parcial de dos hebras procedentes de moléculas dúplex distintas.

Se forman: DNAs Híbridos de doble cadena, con regiones de apareamiento y de no apareamiento.

Formación de moléculas dúplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen recibe el nombre de
HIBRIDACION.
A mayor grado de hibridación , mayor conexión evolutiva entre especies , y viceversa.

Los ensayos de hibridación se basan en la mezcla de hebras sencillas de ácido nucleico muestra o diana, no marcado, con una sonda de secuencia conocida, marcada, bajo condiciones experimentales que permiten el apareamiento de bases complementarias.
MÉTODOS DE ENSAYO
DE HIBRIDACIÓN
Si la sonda o el DNA diana son de doble hebra han de ser desnaturalizados por calor o tratamiento alcalino.
Una vez separadas, se
permite la renaturalización.
Los ensayos de hibridación se pueden clasificar en 3 grupos:
Hibridación fase líquida

Hibridación fase sólida
Dot blot y slot-blot
Hibridación Southern
Hibridación Northner
Hibridación in situ
HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA
Utiliza muestra de DNA o RNA en disolución, se realiza su hibridación con la sonda; al estar ambas disueltas, la cinética es más rápida. Además todas las moléculas diana son igualmente accesibles.

HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
Más simple.
Permite procesar varias muestras simultáneamente.
Facilita control de hibridación.
El esquema general de este tipo de ensayos se puede ilustrar con el método comúnmente empleado para identificar, de entre varias colonias bacterianas en placas de cultivo con agar, aquellas que contienen un gen o fragmento de ADN de interés bajo la forma de plásmido recombinante.
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