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Enzimas de Aplicación en Biología Molecular

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by

Isa Gomez

on 7 December 2016

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Transcript of Enzimas de Aplicación en Biología Molecular

Índice
Enzimas de Aplicación
en Biología Molecular

1. Introducción a las Enzimas
Conceptos de:
Enzima
Catalizador biológico
Sustrato
Cofactores y coenzimas
Mecanismo de Acción
2. Factores que influyen a la velocidad de
reacción
3. Regulación Enzimática
4. Clasificación de las Enzimas
5. Enzimas empleadas en Biología Molecular
Enzimas de Restricción
Transcriptasa Inversa
Topoisomerasa
DNA ligasa
Taq Polimerasa
Tdt

¿Que son las Enzimas?
Energía de Activación
Cofactores y Coenzimas
1. Introducción a las Enzimas
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que cataliza reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles.
Catalizadores Biológicos
Permite acelerar los procesos del metabolismo de los seres vivos.
¿Qué son los Sustratos?
Una molécula sobre la cual actúa una enzima

E + S ES EP E + P
La energía mínima necesaria para que se produzca una reacción química dada
Mecanismo de Acción Enzimática
Concentración de Sustrato
Al aumenta la concentración de sustrato aumenta la velocidad de reacción.
Temperatura
Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de reacción hasta alcanzar la temperatura óptima que corresponde a la máxima velocidad de reacción.
pH
Cada enzima realiza su acción dentro de un determinado intervalo de pH, dentro de este intervalo habrá un pH óptimo donde la actividad enzimatica será máxima.
2. Factores que influyen en la velocidad de reacción
Inhibidores
Compuestos químicos que se unen a la enzima disminuyendo o impidiendo su actividad.

Puede ser
- Reversible
- Irreversible
Competitiva
No competitiva
3. Regulación enzimática
4. Clasificación de las Enzimas
Todos los procesos celulares regulados y se basa en poder aumentar o disminuir el flujo a través de una vía
- Generales
- Específicos
5. Enzimas empleadas en Biología Molecular
Descubierta por Daniel Nathans y Hamilton O. Smith en 1975. Premio
Novel en 1978.

Enzimas de Restricción
Son proteínas bacterianas, son su
defensa contra bacteriófagos.

Son las tijeras moleculares.
Rompen los enlaces fosfodiéster.
Tipos de Enzimas de Restricción
Tipo I:
Corta y metilan. Corta al azar
Tipo III:
Corta y metilan. Cortan unas 25-24 pb más allá
de la secuencia de reconocimiento.
No se emplean en Biología Molecular
Tipo II:
Sistema de corte y metilación separadas. Reconocen
una secuencia específica de nucleótidos y cortan
dentro de la secuencia o adyacente a ella.

Empleadas en Biología Molecular
Secuencias de reconocimiento palindrómicas y de una longitud de 4 a 6 nucleótidos.
Isoschizomeros:
aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen y cortan en la misma secuencia de DNA.

Neosquizómeros:
aquellas enzimas que tienen el mismo sitio de reconocimiento pero diferente sitio de corte.
Transcripatasa Inversa (RT)
DNA-polimerasa que sintetiza DNA de doble cadena empleando como molde ARN.

- virus del sarcoma de Rous por Howard Temin
- virus de la leucemia murina por David Baltimore en 1970
Premio Novel de Medicina en 1975.
Dos subunidades
p66: dominio RNAsaH
p51
Requiere cebador
-
In vitro:
ARN o ADN
- In vivo:
ARNt y cationes
DNA Ligasa
- Enzima de unión de nucleótidos
- Enlace fosfodiéster entre extremos 5´de un nucleótido y 3´del otro

- Localizar el fragmento de ADN con el gen
que se quiere clonar.
- Elegir el plásmido que sirva para clonar
el gen en cuestión.
- Fragmentación de ambos ADN por
enzimas de restricción.
- Formación del ADN recombinante.
- Introducción del vector con ADN r
recombinante en la célula diana.
- Proliferación de la célula diana.
- Detección y selección de clones en el
cultivo.
- ADN recombinante
- Clonación
Taq Polimerasa
Actividad polimerasa 5´-3´ añadiendo dNTPs o bases nitrogenadas.
Thomas D. Brock: Thermus aquaticus
Kary Mullis: premio Nobel. Taq soporta altas temperaturas (+90ºC)
Desoxinucleotidil transferasa terminal
o Tdt
- ADN-polimerasa
- Localizada en el núcleo celular
- Incorporación de desoxinucleótidos a los extremos 3' OH
- No requiere cebadores ni cadena molde
- Se usan en el marcaje radiactivo de oligonuceótidos de ADN agregando isótopos radiactivos 32P al extremo 3´OH




Usos:
- Diferenciación histológica entre el linfoma linfolástico y el linfoma
de Buwkitt
- Caracterización inmunológica de células sanguíneas
Terapia Retroviral

Inhibidores de transcripción inversa:
- Nucleósidos y análogos de nucleódidos: zidovudina, .
- No nucleósidos: nevirapina.
RT-PCR

Diagnóstico molecular y investigación científica
Insertar genes eucariota en organismos procariota
Topoisomerasas (TOP)
TOP I
- monoméricas 100 KDa
- 4 dominios y cavidad central
- Cortan una sola hebra de la doble hélice
- No requiere ATP
- Sitio catalítico Tyr
Topoisomerasa (TOP)
TOP II
- Cortan las dos cadenas de
la doble hélice
- Requieren ATP
- Sitio catalítico dos Try
- Un tipo especial las
DNA girasa.
Usos de las topoisomerasas como dianas en el tratamiento de enfermedades
- novobiocina y la ciprofloxacina: Antibióticos,
inhiben la actividad de las TOP II.

- Camptotecina: Antitumoral
inhibe a TOP I, impide la unión de la enzima al DNA
Bibliografía

- Thomas M Delvin. “Bioquímica. Libro de texto con Aplicaciones Clínicas” (2004). Editorial Reverté. 4ª Edición.
- Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick. “Biologia Molecular del Gen” (2008). Editorial Médica Panamericana. 5ª Edición.
- Voet, Pratt. “Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular” (2009). Editorial Medica Panamericana. 2ª Edición.
- Donald Voet. Judith G. Voet. “Bioquímica”(2004). Editorial Médica Panamericana. 3ª Edición.
- Werner Muller-Esterl. “Bioquímica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida” (2008). Editorial Reverté.
- biblioteca.ucm.es/tesis/far/ucm-t26638.pdf
- http://cientificoindignado.blogspot.com.es/2016/03/VIH-SIDA-retrotranscriptasa-hTERT.html
- James D. Watson: Biología molecular del gen, 5ª Edición. Ed. Panamericana.
- http://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/taq-polimerasa
- http://www.leicabiosystems.com/es/ihc-ish/reactivos-novocastra/anticuerpos-primarios/detalles/product/terminal-deoxynucleotidyl-transferase/
- Emilio Gómez de la Concha: Inmunologia y linfomas


¡Gracias!
Laura Girón
Andrea Alcaide
Lucia Armario
Isabel Gómez
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