Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Hodowle komórkowe

No description
by

Magda Ka

on 17 January 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Hodowle komórkowe


in vitro
in situ
in vivro
ex vivo – materiał biologiczny jest pozyskiwany z żywego organizmu w celu jego modyfikacji in vitro i ponownego podania z powrotem do organizmu, z którego go pozyskano np. szczepionki przeciwnowotworowe
ex mortulo
Hodowla in vitro
utrzymywnie oddzielonych od organizmu komórek, tkanek lub narządów w warunkach laboratoryjnych przez okres dłuższy niż 24h
pozwala na obserwacje zachowania się żywych komórek pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu innych tkanek i całego organizmu

Prawidłowa czynność komórek zależy od:
składu środowiska (określone stężenie sybstratów, tlenu, pH)
zewnętrznych czynników fizycznych (temperatura, osmolarność, ciśnienie, promieniowanie)
Hodowla komórek
- utrzymanie przy życiu komórek poza ich środowiskiem naturalnym, przez umieszczenie ich w odpowiednich pożywkach; hodowla ta cechuje się brakiem wytworzenia wyżej zorganizowanych struktur)
Hodowla tkanek
Hodowla organotypowa
- embrionalne zawiązki narządów jak i całe narządy pobrane z dojrzałych organizmów
Podstawowe pojęcia
Hodowla pierwotna
– zapoczątkowana pobraniem komórek lub tkanek bezpośrednio z organizmu

Ustalona linia komórkowa
– komórki wielokrotnie pasażowane

Kokultury – hodowle mieszane
– hodowle dwóch lub więcej rodzajów komórek oddziałujących na siebie

Linia komórkowa
– hodowla uzyskana po przeniesieniu hodowli pierwotnej do odrębnego naczynia
Linie komórkowe cd.
ciągłe
– o nieograniczonym czasie życia
kom. nowotworowe
kom. immortalizowane (unieśmiertelnione)

półciągłe
– wywodzą się z tkanki płodowej ludzkiej lub zwierzęcej; mają duży potencjał proliferacyjny

kom. prawidłowych
– mają określoną ilość podziałów; najdroższe

Linia diploidalna
- 75% lub więcej kom. ma diploidalną liczbę chromosomów

Linia heteroploidalna
- o zróżnicowanej ploidii (np. linie nowotworowe o nieograniczonym czasie wzrostu) -
mniej niż 75% ma diploidalną liczbę chromosomów

Szczep komórkowy
– wyprowadzony z hodowli pierwotnej lub linii komórkowej poprzez wyodrębnienie komórek o określonej, utrzymującej się charakterystyce

Klon komórkowy
– populacja komórkowa wywodząca się z jednej kom. macierzystej i powstała na drodze jej wielokrotnych podziałów

Monolayer
- jednowarstwowa hodowla komórek (komórki nie rosną jedna na drugiej)


Hodowle komórkowe
Rodzaje hodowli
Warunki hodowli
odpowiednia pożywka
czynniki wzrostowe
ochrona przed mikroorganizmami
temperatura 36,6-37°C
stała wilgotność
pH zbliżone do naturalnego
środowisko 5% CO2
Pożywki
Naturalne
(osocze, surowica, wyciągi tkankowe)
Sztuczne
– o ściśle określonym składzie dobranym do wymagań danej hodowli

Surowica
Bydlęca BS, płodowa bydlęca FBS, końska HoS

Zawiera albuminy, hormony, białka i czynniki wpływające na wzrost i podział komórek

Można ją zastąpić odpowidnio dobranymi składnikami w formie chemicznie czystej – hormony; czynniki wzrostu fibroblastów, naskórka; insulinopodobne czynniki wzrostu; transferyna

Środowisko hodowli
System otwarty
– hodowla w naczyniu, w którym materiał hodowlany kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym – skład tego środowiska musi być ściśle kontrolowany, głównie przez utrzymanie określonego stężenia gazów
System zamknięty
– hodowla jest w hermetycznie zamkniętych naczyniach; zapewniając komórką stałe warunki środowiska; jest to tzw. układ ciągły do którego doprowadzamy i odprowadzamy składniki

Granica Hayflicka
Liczba podziałów komórki jest ograniczona, proporcjonalna do długości życia organizmu i zależy od rodzaju komórki i organizmu, z którego pochodzi
Czas życia komórek:

Komórki diploidalne
– prawidłowe – ograniczony czas wzrostu i podziałów
Linie heteroploidalne
– komórki nowotworowe, komórki immortalizowane(nieśmiertelne) – nieograniczony czas wzrostu i podziału komórek
Komórki macierzyste
– niezróżnicowane komórki, kom.embrionalne – możliwość stosunkowo długiego czasu hodowli – w zależności od warunków
Hodowle komórek układu immunologicznego
Najpopularniejsze w laboratoriach immunologicznych są hodowle:
leukocytów krwi lub szpiku
Badanie odpowiedzi komórek immunokompetentnych na antygeny, cytokiny, hormony, neuroprzekaźniki itd. albo rozmaite kombinacje tych czynników.
Cel badań
Stosowane hodowle:
komórki jednego typu lub kokultury dwóch lub więcej typów komórek, bądź też hodowle narządów limfatycznych
Warunki hodowli
Pożywkę wzbogaca się:
czynnikami wzrostu
interleukinami – np. do hodowli kom tucznych dodajemy IL-3
antybiotykami
substancjami grzybobójczymi

Pożywkę wzbogaca się często dodatkiem inaktywowanej surowicy płodowej – FCS, bydlęcej, końskiej lub autologicznej. Częstym dodatkiem są też L-glutamina i 2-merkaptoetanol.
Niektóre typy leukocytów wymagają wzbogacenia pożywki o czynniki wzrostu.
Pozyskiwanie komórek
Najdogodniejsze jest pozyskanie z organizmu gotowej zawiesiny komórek odpornościowych.
W przypadku kręgowców takim źródłem leukocytów są:
krew obwodowa
szpik kostny
jama otrzewnej
śródskórne worki limfatyczne i worki płucne płazó bezogonowych
Pozyskanie leukocytów
wymaga zastosowania:
płynu fizjologicznego (PBS), którego osmolarność jest dostosowana do płynów ustrojowych
heparyny lub EDTA – zapobiega tworzeniu agregatów
Końcowym efektem jest otrzymanie komórek nieprzylegających do podłoża(np. limfocyty) i przylegających (np. makrofagi)

Określenie składu zawiesiny leukocytów
barwienie techniką Wrighta lub MGG po utrwaleniu w metanolu lub wysuszeniu


Przed założeniem hodowli często konieczne jest ustalenie zawartości w zawiesinie określonego typu komórek.

Pozyskiwanie
z jam ciała
z worków limfatycznych i jamy płuc płazów bezogonowych
z jamy otrzewnej
Pozyskiwanie komórek z narządów limfatycznych
Pozyskiwanie leukocytów plamek mlecznych myszy
Pozyskiwanie makrofagów jądrowych
Pozyskiwanie leukocytów jelita
Pozyskiwanie komórek odpornościowych z narządów nielimfatycznych

Testy identyfikacji komórek:
fiolet krystaliczny
safranina
czerwień obojętna
błękit trypanu/jodek propidyny
Testy proliferacji
neutrofile
- niezdolne do proliferacji in vitro
monocyty, makrofagi
– proliferacja ograniczona
limfocyty
– duża aktywność proliferacyjna; można ją przyspieszyć dodając kom. APC i/lub odpowiednie mitogeny
Inne testy
badanie aktywności cytotoksycznej
badanie endocytozy
badanie pinocytozy
badanie fagocytozy
badanie zdolności przylegania do podłoża
Synteza czynników rozpuszczalnych przez komórki stymulowane In vitro (synteza tlenku azotu, cytokin)
Testy biologiczne
W laboratoriach immunologicznych hoduje się zazwyczaj linie komórkowe będące bioindykatorami obecności cytokin.

Magdalena Kałucka 31F
Wzrost komórek w hodowli
Faza lag
– faza G1 cyklu komórkowego
Faza log
– duża żywotność komórek, wysoki poziom metabolizmu
Faza plateau
– stacjonarna, następuje przyleganie komórek do siebie i zahamowanie wzrostu

Warunki hodowli
Najkorzystniejsze dla komórek jest prowadzenie hodowli w inkubatorach o kontrolowanej temperaturze, wilgotności i pH, w atmosferze zawierającej 5% CO2.
Full transcript