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TESIS

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by

Lucas Gutierrez

on 2 November 2015

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Transcript of TESIS

Se construyeron 12 complejos ES-INH.

El INH se ubicó en cada posición encontrada por el docking.

Cada complejo se sometió a 3 ns de simulación de DM.

Se utilizó el protocolo MM/PBSA.
BUSQUEDA Y ESTUDIO POR MODELADO
MOLECULAR DEL EXOSITIO DE
ß-SECRETASA (BACE1)

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Trastorno cerebral degenerativo.

Deterioro progresivo de las facultades mentales.

Afecta inicialmente la capacidad cognitiva.

Incapacitación y muerte.
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Principal causa de demencia en personas mayores de 65 años.

Actualmente 24 millones de personas padecen la enfermedad.

Se estima que 80 millones de personas se verán afectadas en el año 2040.

Supera los costos de los pacientes con cáncer o enfermedades cardiovasculares.
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Inhibidores de acetilcolinesterasa:

Donepezilo.
Rivastigmina.
Galantamina.

Memantina.
MECANISMO PATOLOGICO
Hipótesis de la cascada amiloide:
SISTEMAS MOLECULARES REDUCIDOS
Se tomó la estructura de mínima energía de cada complejo.

Los residuos a <=6 A del inhibidor mas extenso.

Optimización PM6.

Cálculos puntuales de energía ab initio y DFT.
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
ß-SECRETASA: GENERALIDADES
CARACTERIZACION DEL EXOSITIO
CARACTERIZACION DEL EXOSITIO
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
Enlace puente de hidrógeno entre el grupo metilo (Ace) y el grupo N-H Ace-Tyr1 con el grupo carboxilato (Asp317).


Enlace puente de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de Tyr1 el grupo amida de Gln316.
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
Se eligieron tres de los nueve péptidos aquí estudiados.

Capacidad inhibitoria de los mismos (alta, intermedia y baja).
SISTEMAS MOLECULARES REDUCIDOS
Se construyeron los complejos ES-INH.

Los inhibidores se crearon tomando como base a INH de C4.

Cada complejo se sometió a 3 ns de simulación de DM.
BUSQUEDA DEL EXOSITIO
CONSTRUCCION DEL MODELO
Porcentaje de inhibición.

Tamaño.

Se construyó a partir de la secuencia:

Ac-Tyr-Pro-Tyr-Phe-Ile-Pro-Leu-NH2
OBJETIVOS
Localizar el exositio sobre la superficie de BACE1.

Caracterizar estructural y termodinámicamente.

Simular complejos ligando-exositio mediante cálculos mecano-cuánticos.

Estudiar la influencia en el comportamiento dinámico de BACE1 que presenta la ocupancia del exositio.
ß-SECRETASA: GENERALIDADES
La máxima actividad es a pH 4.5-5.

Se localiza en los endosomas.

Forma parte y es activa en balsas lipídicas.
BUSQUEDA DEL EXOSITIO
CONSTRUCCION DEL MODELO
Código PDB 1MH4.

BACE1 unida a un peptidomimético.

Estado de ionización de los residuos de la enzima.

Asp32 se simuló en su estado protonado.
ß-SECRETASA: GENERALIDADES
Además del sitio catalítico, BACE1 contiene un bolsillo de unión adicional llamado “EXOSITIO”.

Estructuralmente diferente al sitio activo.

Inhibidores más selectivos.

Ausencia de evidencia cristalográfica.
BUSQUEDA DEL EXOSITIO
Intenta encontrar el modo de unión más adecuado entre dos moléculas.

Si las dos moléculas “interactúan”.

Maximiza la “interacción” para disminuir la “energía” total del complejo.
ANTECEDENTES
Kornacker y col. reportaron una serie de inhibidores peptídicos.

Forman complejos ternarios.
BUSQUEDA Y CARACTERIZACION DEL EXOSITIO DE BACE1
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
Enlace puente de hidrógeno entre el grupo carbonilo (Gln316) y el Ca-H de Gln271 (loop D).


Enlace puente de hidrógeno entre el grupo carboxilato de Asp318 y los grupos N-H y metilo de Ala272.
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
Memapsin 2, ASP-2, BACE1 (ß-APP Cleaving Enzyme).

Es una proteasa aspártica.

Cada lóbulo contiene un residuo Asp.

Harpin loop (flap).

Segmentos de inserción.
Modelo ES:
Inhibidor: INH
¿Qué es el DOCKING molecular?
180°
INH Secuencia % Inhib.

9 Ac-
YPYFIPL
-NH2 71
8 Ac-TT
YPYFIPL
P-NH2 70
7 Ac-T
YPYFIPL
P-NH2 67
6

Ac-
YPYFIPL
P-NH2 65
5 Ac-
YPYFIP
-NH2 37
4

Ac-
YPYFI
-NH2 27
3 Ac-
IPL
P-NH2 2.5
2 Ac-
PL
P-NH2 2.5
1 Ac-
YFIPL
P-NH2 0
Gutiérrez, Lucas Joel

Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis-Argentina.

9
4
1
9
¿COMO AFECTA LA OCUPANCIA DEL EXOSITIO AL COMPORTAMIENTO DINAMICO DE BACE1?
CONCLUSIONES
El reciente reporte de la estructura cristalográfica de BACE1 unida a un anticuerpo monoclonal validó la ubicación propuesta para el exositio.
CONCLUSIONES
Mediante la técnica de Análisis de Componentes Principales se propuso el mecanismo de inhibición de BACE1 mediada por el exosito.

La presencia del inhibidor en el exositio provoca la reducción en el movimiento de los loops A, D y F.

Esto dificulta la entrada del sustrato al sitio catalítico como así también evita que este se acomode adecuadamente para su ruptura proteolítica.
CONCLUSIONES
Se determinó la ubicación del EXOSITIO de BACE1.


Se caracterizó estructural y termodinámicamente.


Se analizó a nivel atómico-cuántico el modo de unión de diversos inhibidores en el EXOSITIO.
EFECTO SOBRE LOS SEGMENTOS DE INSERCION
Estos loops están involucrados en el movimiento de cierre y apertura de la enzima.

El loop 10s y el loop A se mueven en dirección al flap.

Loop F se aleja de la cavidad catalítica.

Regulan la entrada del sustrato y lo mantienen firme dentro de la cavidad para su ruptura.
EFECTOS SOBRE EL SITIO CATALITICO
RMSD sobre los C alfa de los 32 residuos del sitio catalítico.

En un principio hay una diferencia de 0.75 A.

Convergen en un mismo valor.

El INH no influye en forma significativa sobre la estructura del sitio catalítico.
ESTUDIO ELECTRONICO DEL MODO DE UNION
Deformación de las cadenas principales del exositio después de la unión a 1 (cian), 4 (magenta) y 9 (blanco).
MODELO E Y E-INH
Ambos modelos se construyeron a partir del C4.

Para E se eliminaron las coordenadas del sustrato y el inhibidor.

El modelo E-INH se creo eliminando las coordenadas del sustrato.

Estos sistemas se sometieron a 20 ns de simulación de DM.
VERIFICACION EXPERIMENTAL
EFECTO SOBRE LOS SEGMENTOS DE INSERCION
EFECTO SOBRE LOS SEGMENTOS DE INSERCION
EFECTOS SOBRE EL SITIO CATALITICO
Torcedura, formado por Trp76C-Val69N-Thr72Ca-Gln73Ca.

Z’, distancia entre el C alfa de Gln73 y el Cß de Asp32.
EFECTOS SOBRE EL SITIO CATALITICO
La conformación del flap depende del ángulo diedro chi1.

TyrBack chi1=-60° (gris).

TyrUp chi1=+60° (naranja).

TyrDown chi1=180° (verde).
EFECTO SOBRE LOS SEGMENTOS DE INSERCION
Los autovalores de E-INH decrecen rápidamente respecto de E.


Los dos primeros autovalores representan el 51% y el 56% de los movimientos colectivos para E y E-INH.
4
1
E
E-INH
El carbonilo del grupo Acetilo actúa como un aceptor-H frente a los residuos Gln271 y Ala272 (loop D).

El grupo N-H de Tyr1 actúa como donor-H frente al grupo carboxilato de Asp317 (loop F).
El grupo carboxilato de Asp317 (loop F) actúa como aceptor-H frente al Acetilo y Tyr1.

Enlace puente de hidrógeno entre el grupo hidróxilo de Tyr1 y el grupo amida de Gln316 (loop F).
Enlace puente de hidrógeno entre el carbonilo de Gln316 (loop F) y el H alfa de Gln271 (loop D).

El grupo carboxilato de Asp318 (loop F) actúa como aceptor-H frente a Ala272 (loop D).
¿CUAL DE LOS DOCE SITIOS PROPUESTOS POR DOCKING MOLECULAR CORRESPONDE A LA UBICACION DEL EXOSITIO?
Biochemistry 2005, 44, 11567
US Patent 7314726 2008
Biochemistry 2005, 44, 11567
Journal of Biological Chemistry 2011, 286, 8677.
Science Translational Medicine 2011, 3, 1.
Estatinas.
51%
56%
E
E-INH
AGRADECIMIENTOS
loop D
loop F
Análisis de Componentes Principales
BACE1-INH
BACE1-Acm
Torcedura
Z'
BACE1-Acm
BACE1-INH
Structural and thermodynamic characteristics of the exosite binding pocket on the human BACE1: A molecular modeling approach., Gutierrez, Lucas J.; Baldoni, Héctor A.; Enriz, Ricardo D. The Journal of Physical Chemistry A. 114 (2010) 10261-10269.

Insights into the anti-BACE1 antibody recognition., Gutierrez, Lucas J.; Baldoni, Héctor A.; Enriz, Ricardo D. Enviado a Journal of Biomolecular Structure & Dynamics.

Charge density topological analysis of exocite binding peptides with inhibitory activity against BACE1. Gutierrez, Lucas J.; Angelina, Emilio; Enriz, Ricardo D.; Baldoni, Héctor A. En redacción.
PUBLICACIONES CIENTIFICAS
Essential dynamics on different biological system: Fis protein, tvMyb1ctranscriptional factor and BACE1 enzyme., Gutierrez, Lucas J.; Baldoni,cHéctor A.; Enriz, Ricardo D. Molecular Dynamics "Studies of Synthetic andcBiological Macromolecules", ISBN 978-953-51-0444-5
CAPITULOS DE LIBRO
Búsqueda por modelado molecular del exositio de -secretasa (BACE1). Gutierrez Lucas Joel; WORSHOP: QUIMICA COMPUTACIONAL DE PROTEINAS.

Búsqueda por modelado molecular del exositio de -secretasa (BACE1). Gutierrez, Lucas J.; Enriz, Ricardo D.; Baldoni, Héctor A.; XVI CONGRESO ARGENTINO DE FISICOQUIMICA Y QUIMICA INORGANICA.

Características estructurales y termodinámicas del exositio de BACE1. Un estudio de modelado molecular. Exposición oral. Gutierrez, Lucas J.; Enriz, Ricardo D.; Baldoni, Héctor A.; XXVIII CONGRESO ARGENTINO DE QUIMICA Y 4toWORKSHOP DE QUIMICA MEDICINAL.
PRESENTACIONES A CONGRESOS
Estudio de las interacciones entre BACE1 e inhibidores por simulaciones de dinámica molecular y cálculos MM-GBSA. Gutierrez, Lucas J.; Enriz, Ricardo D.; Baldoni, Héctor A.; 1er WORKSHOP ARGENTINO DE BIOFISICOQUIMICA DE PROTEINAS, Mayo de 2011 en Córdoba.

Inhibición alostérica de BACE1 mediada por exositio. Gutierrez, Lucas J.; Tosso, Rodrigo; Enriz, Ricardo D.; Baldoni, Héctor A. XXIX CONGRESO ARGENTINO DE QUIMICA ÇENTENARIO DE LA ASOCIACION QUIMICA ARGENTINA", octubre de 2012 en Mar del Plata.
PRESENTACIONES A CONGRESOS
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