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WESTERN BLOT Y ELISA

FUNDAMENTOS INMUNOLOGICOS Y TECNICOS
by

Joanna Patricia Saavedra Ayala

on 26 November 2014

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Transcript of WESTERN BLOT Y ELISA

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
Joanna Patricia Saavedra Ayala
CONCEPTO
Uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, obteniendo conjugados con actividad tanto inmunológica como enzimática
ASPECTOS RELEVANTES
Superficie de la placa
Tapizado de la placa -adsorción-
Bloqueo de sitios de unión inespecíficos
Lavado
Método de detección
TIPOS DE ELISA
Dependiendo de la Actividad Enzimatica:
WESTERN BLOT
Detección y cuantificación inmunológica de proteínas
ELISA
Tópicos Selectos de Biología Molecular
Permite identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas
1.Separación por tamaño
2. Transferencia a soporte sólido
3. Detección de la proteína de interés mediante reacciones antígeno-anticuerpo
Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas mediante ruptura mecánica o química
Métodos físicos
Métodos Químicos
Evitar cualquier actividad proteasica
Inhibidores
Ciclos de congelación/descongelación
Añadir inhibidores de proteasas en el tampón de lisis
Mantener las muestras frías durante el proceso
Electroforesis
SDS-PAGE
separación de proteínas en función de la masa molecular.
CUANTIFICACION
Determinar la cantidad de proteína extraida
Métodos de cuantificación
Curva Standard para determinación de Proteínas
SDS
B-MERCAPTOETANOL
DITIOTREITOL

En proteínas nativas
5-10%
ELECTROFORESIS NATIVA

Proteínas migran sin desnaturalización.
En función de su carga, de su tamaño y de su forma.
mantienen las interacciones entre subunidades y entre proteínas.
Los sistemas tampón (buffer):
tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).
Rango de separación de proteínas según porcentaje de Acrilamida
EXPERIMENTO
Incorporar controles y estándares para la validación de los resultados
Marcadores de Peso molecular
Controles Positivos y Negativos
Control de Carga
Péptidos de Bloqueo
TRANSFERENCIA
permite que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos.
TIPOS DE MEMBRANAS
NITROCELULOSA
Mas económicas
Mas utilizadas
Menor ruido de fondo
No requiere pretratamiento con Metanol
PVDF
Mayor costo
Mayor resistencia mecánica
Resistencia a la SDS
Mayor unión que la nitrocelulosa
Mas ruido de fondo
Fluoruro de polivinilideno
DIFUSION
En gel se pone en contacto con la membrana, en un medio tampón, el cual asciende por capilaridad arrastrando las proteínas a la membrana
ELECTROTRANSFERENCIA
Es el mas utilizado y el mas recomendado
VACIO
Adiciona al método anterior el uso de una bomba de vacío, que succiona las proteínas desde el gel hasta su retención en la membrana
Se debe bloquear la unión de proteínas a la membrana en los lugares que hayan quedado libres, posteriormente a la transferencia, para reducir la presencia de uniones no especificas del anticuerpo
Manipular sin guantes
Burbujas de aire entre el gel y la membrana.
Sobrecalentamiento en transferencia
Ajustar condiciones de transferencia al tamaño de la proteína
Marcadores de tamaño preteñidos en membrana indican transferencia completa
Teñir la membrana para asegurar la eficacia de la transferencia
DETECCION
FUNDAMENTO
ANTIGENO
ANTICUERPO
ESPECIFICIDAD
EPITOPOS
Polisacáridos
Lípidos
Proteínas
Complejos
BIBLIOGRAFIA
Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/
Protein Blotting Methods. http://www.bio-rad.com/es-mx/applications-technologies/protein-blotting-methods#1
Análisis de Proteínas, Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección. http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf
Inmunoglobulina G. http://biomodel.uah.es/model1j/prot/igg-indice.htm
Shared idiotypes among monoclonal antibodies specific for different immunodominant sugars of lipopolysaccharide of different Gram-negative bacteria. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6175969
Idiotypes. http://www.roitt.com/elspdf/Idiotypes.pdf
http://www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_05.htm
Inmunoquimica. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
The Epitopic and Structural Characterization of Brucella suis Biovar 2 O-Polysaccharide Demonstrate the Existence of a New M-Negative C-Negative Smooth Brucella Serovar. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3545991/pdf/pone.0053941.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/ELISA_bloqueo.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/ELISA_deteccion.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/ELISA_lavado.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/ELISA_tapizado.pdf
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/ELISA_superficie.pdf
CDR: Regiones determinantes de complementariedad
ESTRUCTURA
MONOCLONAL
anticuerpo específico para un único epítopo de un antígeno producido por una célula híbrida
POLICLONAL
Derivados de diferentes líneas de células B, por la inyección reiterada de un antígeno en un animal.


mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra de un antígeno específico, cada una reconociendo diferentes epitopes.
-fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral-
sustancia "foránea" que desencadena una respuesta inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles.
Paratopos
Conformacionales
estructura terciaria
Lineales

estructura primaria
Estabilidad estructural
pm 8000-10000 daltons
Ser reconocido por el sistema inmune
Elementos estructurales diferentes de los del huésped.
Antígenos peptídicos: 30% de aa inmunogénicos -Lisina(K),Arginina(R),Acido glutamico(E),Acido aspartico(D), Glutamina(Q),Asparagina(N)
Los antígenos naturales suelen tener mas de un epítopo
-Antígeno multivalente-
REACTIVIDAD CRUZADA
Mayor ruido de fondo
Mayor variabilidad entre lotes
Mayor probabilidad de reactividad cruzada
Excelentes anticuerpos primarios en un ensayo o para detectar antígenos en un tejido
menos tinción de fondo que los anticuerpos policlonales.
Altamente homogeneos
Eleveda reproducibilidad entre experimentos
Altamente eficientes para la unión al antígeno dentro de una mezcla de moléculas relacionadas
Menor probabilidad de reaccion cruzada
más tolerantes a pequeños cambios en la naturaleza del antígeno
Mayor sensibilidad
generados en una variedad de especies -conejos, cabras, ovejas, asnos, gallinas-
Multiples opciones en el diseño experimental.
proveen una detección más robusta.
menos costosos.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Regiones de un inmunogeno -Complejas secuencias específicas en una superficie de unión- inmunologicamente activas con capacidad de union a receptores de membranas ag-específicos en los linfocitos o Abs secretados
-Determinantes antigénicos-
Antigeno O LPS Brucella-S
A:≥ 5 unidades consecutivas α1→2
M:Exclusivamente α1→3
C: α1→2 tri/tetrasacaridos y α1→3
Homopolimero de Perosamina unida a azucares mediante enlaces α1→2 y/o enlaces α1→3
(N-formyl-perosamine)
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Menor sensibilidad.
Mayor costo
Mayor tiempo de producción
Requiere equipamiento especializado.
poca tolerancia -puede dejar de reconocer al antigeno ante diferentes eventos (polimorfismos, desnaturalizacion, modificaciones quimicas)
DIRECTO
INDIRECTO
METODOS
ANALISIS
COLORIMETRIA
FLUORESCENCIA
Marcador: Fluróforo
Producción de fluorescencia tras la excitación de un marcador fluorescente a una longitud de onda específica que luego emite luz a una longitud de onda distinta.

QUIMIOLUMINISCENCIA
Marcador:
Enzima
Horseradish Peroxidase (HRP)
Método de detección más utilizado para el Western Blot.
consiste en la emisión de luz en una reacción de múltiples etapas mediante la cual la enzima HRP cataliza la oxidación del luminol.
Se obtienen picos de emisión de luz después de 5 a 20 min y luego disminuye lentamente, dependiendo de las características del reactivo de detección.
longitud de onda de 425 nm y puede ser detectada por una cámara CCD o por exposición a una película de rayos-X.
Anticuerpos primarios
Anticuerpos secundarios
Anticuerpos primarios
Marcador:
Enzima
Horseradish Peroxidase (HRP) /fosfatasa alcalina (AP)
Substratos cromogenicos se convierten en productos insolubles de color, que precipitan sobre la membrana.

VENTAJAS
DESVENTAJAS
Sencilla de realizar
No requiere camara oscura
No requiere ningun equipo especial
Las membranas se pueden documentar mediante fotografia
Cantidad de colorante directamente proporcional a la cantidad de proteina.
La intensidad de color puede ser medida por espectrofotometria o densitomeria
Menor sensibilidad
El color se desvanece con el tiempo
Altos niveles de actividad
Estabilidad
Bajo costo
Amplia disponibilidad de substratos
la emisión de luz es proporcional a la cantidad de proteína.
La alta sensibilidad de los sustratos quimioluminiscentes hace que sea posible detectar y cuantificar cantidades de proteínas muy pequeñas.
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Requiere cuarto oscuro -sistema Rayos X- ó sistemas de imagen costosos
La intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición.
No permite detecciones multiplex.
Chip fotosensible que convierte la luz en electricidad y cuantifica el voltaje.
Mayor ahorro de tiempo. No hay ninguno paso de desarrollo de sustrato requerido.
reducción de residuos químicos en comparación con los sistemas de detección tanto quimioluminiscentes como cromogénicos.
La señal fluorescente se detecta directamente desde los anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos, sin añadir ningún reactivos adicionales
La señal es estable y no disminuye significativamente
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Reactivos y equipamiento costoso.
Menos sensible que la quimioluminiscencia.
No apto para proteínas poco abundantes.
compatibilidad múltiplex, permite la detección de más de una proteína al mismo tiempo mediante el uso de anticuerpos secundarios marcados con diferentes marcadores.
Alta sensibilidad
No requiere uso de cámara oscura
aporta datos cuantificables
Fácil documentación de resultados
Pueden usarse anticuerpos primarios -en proteinas abundantes-
Dificultades frecuentes
NO VISUALIZACION DE LA PROTEINA DE INTERES
TAMAÑO INCORRECTO DE LA BANDA
BANDAS ARTEFACTUALES
PROBLEMAS EN LA ELECTROFORESIS
RUIDO DE FONDO EXCESIVO
A
B
C
D
E
EJEMPLO
Tesis Doctoral
Juan Ugalde
Objetivo:
Construir una mutante en el gen que codifica para la enzima

fosfoglucomutasa
pgm
de
Brucella abortus
y evaluar su capacidad vacunal
Contextualización:
Brucella abortus
carece de los genes del metabolismo del glucógeno, manteniendo el gen de la fosfoglucomutasa pgm.
Metodología:
Se diseño una mutante por deleción del gen pgm (B2211) y se caracterizó fenotípicamente encontrando que la misma se observaba como una cepa rugosa.
FUNDAMENTO
Especificidad de la Reacción Ag-AC
CONCEPTO
La reacción Ag-Ac es inmovilizada mediante la adsorción de uno de los componentes en un soporte, lo cual facilita su lectura
CONCEPTO
La actividad de la enzima sobre el substrato en presencia de un cromógeno genera un producto coloreado el cual es detectado visualmente
CONCEPTO
La intensidad del color observable es directamente proporcional a la cantidad de analito detectado. Este puede ser cuantificado mediante espectrofotometría o colorimetría
COMPONENTES
Analito
Fase sólida
Conjugado
Substrato
ANALITO
Antigenos
Anticuerpos
FASE SÓLIDA
ADSORCIÓN FISICA
-fuerzas electrostáticas-
FIJACIÓN COVALENTE
Poliestireno
Cloruro de polivinilo
polipropileno
Nylon
Silicona
Acrilamida
Celulosa
Isoticianato
CONJUGADO
Marcador:
Unirse fácilmente ag y ac
Encontrarse en estado puro a un costo razonable
Tener un substrato cromogénico o fluorogénico de fácil preparación
De gran importancia en la estandarización del ELISA
Sensibilidad
Especificidad
Facilidad de lectura
Estabilidad después de la reacción
Requerimientos del substrato:
Solubles en agua
Fácil de manipular
No tóxico/No mutagénico
Bajo costo
SUBSTRATO
COMPETITIVA
NO COMPETITIVA
Analito "compite" con el conjugado por un numero limitado de sitios de unión.
Ausencia de color en muestras positivas
El analito se enfrenta con el antígeno o anticuerpo de la fase sólida y es posteriormente detectado por el conjugado evidenciándose la aparición de color
DIRECTOS
Detecta Antígenos
Anticuerpos primarios
Anticuerpos secundarios
Detecta Anticuerpos
INDIRECTOS
DIRECTO
SANDWICH
SISTEMAS DE DETECCIÓN
Colorimetría
Fluorescencia
Quimioluminiscencia
APLICACIONES
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