Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Büyük Ölçekli DNA Dizileme ve Dizileme Metodlarına Genel Bi

No description
by

Tuğçe DURAN

on 24 December 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Büyük Ölçekli DNA Dizileme ve Dizileme Metodlarına Genel Bi

Pirodizileme:
1996'da Ronaghi ve arkadaşları "Sentez Yoluyla Dizileme" prensibine dayalı olarak "Pyrosequencing" metodu geliştirilmiştir.

Pirodizileme (pyrosequencing) yüksek işlem hacmi ve düşük maliyeti sayesinde geleneksel Sanger dizilemenin yerini almıştır.




DNA DİZİLEME YÖNTEMLERİ
Geleneksel Yöntemler:
Sanger Dideoksi Yöntemi
Maxam- Gilbert Kimyasal Degredasyon Yöntemi

Pirodizileme
Shotgun Tekniği
Nano dizileme
Ligasyon Yoluyla Dizileme
Ion Semikonduktor Dizileme

Büyük Ölçekli DNA Dizileme ve Dizileme Metodları
Tuğçe DURAN

Pirodizileme yöntemi kullanılarak, klonlama yapmaksızın, 7.5 saatte 100-500 milyon bazlık dizileme yapmak mümkündür. Bu sistem daha önce yıllar alan dizileme projelerini haftalar içinde sonuçlandırmayı mümkün kılmıştır.


Sentez yaparak dizileme yapma prensibine dayanır.

DNA sentezi esnasında açığa çıkan pirofosfat’ların saptanması esasına dayanan bir
real-time (gerçek-zamanlı)
kantitatif dizi analizi tekniğidir.

İşlem PCR ürünlerinin tek zincir DNA (ssDNA)' ya dönüşmesi ile başlar .

Tek sarmal DNA kalıp olarak kullanılmak üzere izole edilir, her bir primer çifti
biotin
ile 5' ucundan işaretlenir.

DNA Dizileme
DNA dizi analizleri ya da sekanslama DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir.
İlk dizi analiz çalışmaları 1960'‟lı yılların başında 75-80 nükleotitlik tRNA‟'larla başlanmıştır.
DNA dizileme, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır.

Birçok canlı türünün genom haritaları tamamlanmıştır.

Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.) tespiti yada rekombinant DNA oluşum yapılarının tayininde kullanılır.
Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek embriyolarından alınan DNA’lar bu yöntemle analiz edilerek taşıyıcı embriyolar elenip, genetik hastalık taşımayanların doğması sağlanmaktadır.
Hatta,
Geleneksel teknikler 3 temel basamaktan oluşmaktadır:
DNA'nın Hazırlanması:
Her iki analiz sırasında da tek iplikli DNA parçaları hazırlanır.
DNA dizi analiz yöntemi sırasındaki temel fark DNA fragmentlerinin üretilme biçiminden kaynaklanır.
Reaksiyonlar:
Genel prensip, DNA‟yı işaretlenmiş dört fragman grubuna ayırmaktır.
Her grubu oluşturan reaksiyon baza özeldir; belli bir bazın DNA dizisinde bulunduğu pozisyona uygun uzunlukta fragman oluşturur.
Yüksek Voltajlı Jel Elektroforezi
Jel elektroforezi yüksek çözünürlükteki DNA moleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta da kullanılır.
DNA‟da bulunan dört baza (A, G, C, T) uyan işaretlenmiş fragman grupları elektroforetik olarak yan yana ayrıldıklarında bandlar merdiveni elde edilir.
Maxam-Gilbert Yöntemi(Kimyasal Kırılma)
Farklı uzunluktaki DNA parçalarının oluşumu ile sonlanan DNA’ yı kesmek için kimyasalların (
Hidrazin, dimetil sülfat
ya da
formik asit
) kullanıldığı yöntemdir.
Yöntemin temel prensibi, DNA’ da bulunan bazların kimyasallar kullanılarak değiştirilmesine ve daha sonra değişikliğe uğramış nükleotidlerin (
Piperidin
) bulunduğu noktalardan zinciri kırması esasına dayanır.
Tek bir sekans jelinde 40 klonun analiz edilmesini sağlar.



1976-1977'de Harvard Üniversitesi'nden Allan Maxam ve Walter Gilbert, DNA'nın kimyasal modifikasyonu ve ardından onun spesifik bazlarda kesilmesi esasına dayanan bir DNA dizileme yöntemi geliştirdi.
Bu yöntemde nükleotid dizisi saptanacak DNA,
önce 5̀' ucunda P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir.

DNA’ nın iki iplikçiği birbirinden ayrılarak, ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’nın bir ucundan işaretlenmesi sağlanır.

İkinci adımda ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G, T nükleotidlerini kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir.

Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri, jel elektroforezi ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi uygulanarak bantlar görüntülenir.

Yöntemin temeli, DNA polimerazın dNTP (deoksiribonükleozid trifosfat) ve ddNTP (dideoksiribonükleozid trifosfat) leri de substrat olarak kullanabilmesi esasına dayanır.




DNA sentezi sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sequenaz enzimlerinden birisi kullanılabilir.

Sanger Dideoksi Sonlandırma Yöntemi
Yöntemi geliştiren Frederick Sanger'dir.
Maxam ve Gilbert yöntemine kıyasla daha verimli olduğu, daha az toksik kimyasal ve radyoaktivite gerektirdiği için kısa sürede hızla yaygınlaşmıştır.
Sanger yönteminin ana ilkesi zincir sonladırıcı olarak ddNTP'ler kullanılmasıdır.
Dezavantajları :
Yöntemin karmaşıklığı
Biyolojik kitlerle kullanılamaması
Zararlı kimyasalların kullanılması
Ölçeklemesinin zor olması
Yavaş olması
Büyük genom dizilemeleri için elverişsiz olması
DNA parçaları dizilemeden önce klonlanmışsa, elde edilen dizide klonlama vektörüne ait kısımlar da olabilir.
Buna karşın, yeni dizileme teknolojilerinde klonlama vektörü olmaz.
Uzunluk farkı bir nükleotit olan büyük DNA parçaları için ayrım gücü yetersizdir.
DNA dizilemesinde ilk 15-40 baz dizisinin kötü kaliteli olması ve 700-900 bazdan sonra dizileme kromatogramının kalitesinin kötüleşmesidir.
Dezavantajları :
Reaksiyon sonunda deoksinükleotidlerle uzamış ve ddNTP lerle sonlanmış diziler elde edilir.

Elde edilen DNA dizilerine jel elektroforezi uygulanabileceği gibi otomatik dizi analizi cihazlarınca okuma yapılabilir.

Jel elektoforezinde DNA parçaları elektriksel alanda uzunluklarına göre sıralanır ve DNA dizisi jelden okunur.


Sanger Dideoksi Yönteminde Kullanılan Kimyasallar
Primerler:
Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA‟nın genomik DNA‟dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır.

Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3' ucu sağlar.

Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.
Kalıp DNA :
Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir.

Yöntemin birinci aşamasında PCR tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır.
Enzimler :
E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I :
Bu enzimin iki büyük
dezavantajı
vardır.
1.
Enzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan bölgelerde istenilen verimle çalışmaması.
2.
Enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonunu yarıda kesmesi.
Ters Transkriptaz :
Çok yaygın bir kullanım alanı yoktur.
Özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir.

Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır.
Sequenaz Enzimleri:
Taq DNA Polimeraz :
Özellikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir.
Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür.
Homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir.
Sanger Yöntemi
Manuel Sekans Yöntemi
Otomatik Sekans Yöntemi
Çift Zincir Sekanslama
Döngüsel Sekanslama
Shotgun Dizileme Metodu :
Bu yöntemde çok büyük klonlanmış DNA parçaları bir çok parçaya bölünerek alt klonlar halinde dizileme yapılır.

DNA parçaları sekanslandıktan sonra orijinal DNA yeniden yapılandırılmaya çalışılır.

Bu yöntemde amaç; hem hız kazanmak hem de doğruluk oranı daha yüksek sonuçlara ulaşmaktır.

Yaklaşık 10000 bazda 1 hata oranı ile çalışıldığı kabul edilir.

Özellikle kromozom analizlerinde ve genom projelerinde tercih edilir.

DNA polimeraz, primer kalıp DNA ve dNTP’ler ortama konulup işaretli nükleotitin yapıya katılması sağlanır.


Karışım dört kısma ayrılarak dört tüpe konulur. Her tüpe gerekli enzim faktörleriyle birlikte düşük derişimli farklı ddNTP’ler konulur ve inkübe edilir.







Kalıp DNA
Primer
dNTP
ddNTP'lerden biri

Kalıp DNA‟' nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir.
T7 Bakteriyofajından elde edilirler.
Enzimin 3'‟-5'‟ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir.
İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır.
Çift Zincir Sekanslama :
Klasik Sanger yönteminde tek zincir kalıp olarak kullanılmasına karşın, bu yöntemde çift zincir DNA kalıp olarak kullanılır. 


Sekans reaksiyonu ana hatlarıyla dört basamaktan ibarettir:
a.
DNA’nın denatürasyonu,
b.
Annealing,
c.
İşaretleme (radyoaktif madde ile)
d.
Sonlandırma basamakları
Döngüsel Sekanslama :

Denatürasyon, “annealing” ve zincir sentez basamağının aynı tüpte birçok defa tekrarlanmasına izin verir.
Döngüsel sekanslama, geleneksel Sanger sekanslama metodunun bir modifikasyonudur.

İşaretleme basamağında radyoaktif madde yerine
floresan boya
kullanılır.

Otoradyogram yerine
lazer
ve
optik
okuma sistemlerinin bir bütünüdür.

Kapiller elektroforez
sisteminin devreye girmesiyle birlikte, sistem daha hızlı ve etkin hale gelmiştir
Otomatik Sekanslama :
Ligasyon Yoluyla Dizileme :
Bu metodta diğerlerinden farklı olarak DNA polimeraz yerine
DNA ligaz
enzimi kullanılır.

Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır, problar kalıp DNA'ya hibridize olur ve primerle ligasyona girer.
Bu yöntem de sentez yoluyla dizileme esasına dayanır.

Direkt moleküler sensor olarak, biyomühendislikle üretilmiş farklı bir polimeraz ve dNTP'ler kullanılır.
Nano Dizileme
Bu metod DNA'nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan
hidrojen iyonları
nın saptanmasına dayanır.

Salınan hidrojen iyonlarının sayısına göre daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir .
Ion Semikonduktor Dizileme
Full transcript