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식품(물)에서 생균수 측정과 대장균 실험

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지현 박

on 29 November 2017

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Transcript of 식품(물)에서 생균수 측정과 대장균 실험

식품(물)에서 생균수 측정과 대장균 실험
목차
1. 식품위생검사 정의와 검사법

2. 식품위생검사
- 시료채취 방법과 생균수 측정법

3. 식품위생검사
- 대장균(군) 검사

1. Presumptive Test (추정 실험)

정성 검사 2. Confirmed Test (확인 실험)

3. Completed Test (완전 실험)

Most Probable Number Method
정량검사
건조필름법
식품위생검사 시료 채취법 (Q3)
※실험상의 교차 오염을 방지하기 위하여 반드시 모든 과정이 무균적으로 수행되어야 한다.

1. 액체 : 채취된 검체를 강하게 진탕하여 혼합

2. 반유동성 : 멸균 도구로 잘 혼합한 후 일정량(10~25ml)을 희석액과 혼합

3. 고체 : 멸균된 도구를 이용해 검체의 여러 부위에서 일정량(10~25g)을 잘게 잘라 채취한 후 희석액과 혼합하고 균질기를 이용해 균질화 시킴
식품위생 검사

식품 등의 안정성을 확보하고 위해식품 등을 판명하기 위해 「식품위생법」에 따른 기준 및 규격 등에 맞는지를 검사하는 것

1. 생균수 측정

2. 식품위생지표 세균 검사

3. 병원성 검사
생균수 측정이란?
식품위생지표 세균 검사란?
병원성 검사란?
병원성균 배양이 까다롭고, 실험자의 감염의 위험이 존재하기 때문에 위생지표세균을 정해 검사 결과가 양성일 때, 인간에게 해를 끼칠 수 있는 균인 병원성균의 존재여부를 검사한다.
102분반 4조
201511000 박지현
201511008 신지원
201511020 정현경
201510991 김정규
생장이 가능한 균의 수를 측정하는 것으로 고체배지에서 형성하는 집락의 수를 측정하여 시료내 생균수를 산출할 수 있다.


Q1- 식품(물) 중에서 생균수 실험을 하는 이유?

식품(물)에 존재하는 균이 병원성이 있을 가능성은 낮지만, 그 수가 많을 경우 부패의 원인이 될 수 있다. 따라서 식품에 존재하는 생균수를 측정하고, 각 식품의 생균수 기준과 비교함으로써 부패정도나 신선도 및 오염도를 측정할 수 있다.
식품(물)이 위생적으로 안전한지 또는 병원성이 있는지를 확인하기 위해 식품위생지표세균의 존재여부를 확인하는 검사



식품위생지표세균는 coliform group이다.
coliform group
fecal coliform
온혈 동물의 장내에 서식하는 비병원성 대장균

44.5℃인 비교적 높은 온도에서 생장 가능

병원성 미생물과 함께 분변으로 배출
non-fecal coliform
장내에 서식하지 않고, 토양이나 물, 동식물 등 환경 전반에 존재하는 fecal coliform 이외의 비병원성 대장균
생균수 측정법
1. Serial Dilution Method (연속희석법)

시료원액은 필요에 따라 희석액으로 10배 단계희석을 하여 희석시료액을 조제
생균수 측정법
2. 표준평판 배양법(Plate Count Agar 사용)

검체와 PCA배지를 패트리 접시에 붓고 희석시료와 배지를 잘 혼합시킨 후 평판에 굳힌다.
35℃에서 24-48시간 배양 후 Colony 측정
생균수 측정법
3. Colony Forming Unit (CFU: 집락형성 단위)

평판당 30~300개의 집락을 생성한 plate를 택하여 집락수 상당 희석배수를 곱하고 그 수치를 1ml중(혹은 1g중)의 세균수 몇 개라고 기재
Lactose를 분해하여 산과 가스를 생성하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성, 무아포(Non-spore forming) 그람음성 간균, fecal coliform과 non-fecal coliform으로 나뉜다.

식품 위생지표세균으로 사용
대장균군 검사
1. Presumptive Test
2. Confirmed Test
Presumptive Test에서 가스를 생성한 균이 Coliform group에 속하는지 확인하는 실험 단계

1) BGLB (Brilliant Green Lactose Bile) Broth 접종

2) EC (Escherichia coli) Broth 접종

3) 대장균 Selective/Differential media 접종
Q2- 위생지표세균으로 대장균군을 선정한 이유?
시료에 위생지표세균(Coliform group)이 존재하는지 추정하는 실험 단계

이용배지(Lactose Broth) : 이당류인 Lactose를 함유하고 있는 액체 배지

Coliform group은 ‘Lactose'를 분해해서 산과 가스를 생성하기 때문에 LB 배지에서 Durham tube내 가스 포집여부를 통해 Coliform group의 존재 추정 가능
※MPN(Most Probable Number) Method (Q4)

세균의 생장을 확인할 수 있는 지표가 Positive인 Test Tube들의 개수로부터 가장 확률적으로 가능성이 있는 균의 수를 구하는 정량 시험법

※건조필름법

시험 용액 1ml를 미리 준비된 대장균군 또는 대장균 건조필름 배지Ⅰ,Ⅱ에 분주한뒤, 각 배지의 Positive에 해당하는 Colony의 수를 세고, 평균을 계산한 뒤, 희석배수를 곱하여 균의 수를 산출하는 정량 실험법
1. Presumptive Test 결과
Positive
(Durham Tube에 가스가 포집됨 ): 시료 내 Coliform group이 존재하는 것으로 ‘추정’ 할 수 있음 -> Confirmed Test 진행


Negative
(Durham Tube에 가스가 포집되지 않음) :Lactose를 분해해 가스를 생성하는 미생물이 존재하지 않음으로 Coliform group이 존재하지 않음
3. Completed Test
4. 정량 검사
2. Confirmed Test
Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) Broth
BGLB Broth는 배지내 포함된 Brilliant Green이 그람양성세균의 생장을 억제하기 때문에 Total coliform group(총 대장균군)을 선택적으로 배양할 수 있다



Presumptive Test에서 가스를 생성한 균이 Coliform group에 속하는지, 아니면 다른 종류(유산균 등)인지 확인할 수 있음
Escherichia coli (EC) Broth
Fecal coliform을 선택적으로 배양할 수 있는 배지

44.5℃ 또는 45.5℃라는 비교적 높은 온도에서 배양함으로써 Fecal Coliform을 선택적으로 배양할 수 있음.

담즙염(그람양성세균의 생장을 억제하는 역할)이 포함되어 있으므로, Presumptive Test에서 가스를 생성한 균이 Coliform group에 속하는지, 아니면 다른 종류(유산균 등)인지 또한 확인할 수 있음
대장균 Selective/Differential media (Q6)
Confirmed Test에 사용되는 모든 대장균Selective/Differential media는 그람음성세균을 선택적으로 생장 시킴

Lactose 발효능을 기반으로 분별
1. MacConkey Agar
3. Endo Agar
1) Mac Conkey Agar 조성의 역할

Crystal Violet, Bile Salts : 그람 양성의 성장을 억제시킴

Lactose : 배지내 포함된 당 기질

Neutral Red : pH 지시자 역할을 함. 배지 내 pH가 6.8 이하에서는 Red, 8.0 이상에서는 Yellow로 나타냄
2. Eosin-Methylene Blue(EMB) Agar
녹색 금속성 광택을 띠는 Colony : E. coli 와 같이 매우 많은 양의 산을 생성하는 경우에 나타나는 Colony. Coliform Group임을 확인.

보라색-검정색 Colony : Lactose 발효능이 있는 그람음성세균인 Coliform Group임을 확인.

무색 Colony : Lactose 발효능이 없으므로 Coliform Group이 아님.
녹색 금속성 광택을 띠는 Colony : E. coli 와 같이 매우 많은 양의 산을 생성하는 경우에 나타나는 Colony. Coliform Group임을 확인.

분홍색-적색 Colony : Lactose 발효능이 있는 그람음성세균인 Coliform Group임을 확인.

연한 분홍색 무색 Colony : Lactose 발효능이 거의
없거나, 아예 없는 경우이므로 Coliform Group이 아님.
1) Eosin-Methylene Blue (EMB) Agar 조성의역할

Methylene blue, Eosin Y : 그람양성세균의 생장을 억제하는 염기성 염색 시약

Lactose : 배지내 포함된 당 기질
1.Mac Conkey Agar 결과

적색 Colony
: Lactose 발효능이 있는 그람음성세균인 Coliform Group임을 확인

무색 Colony
: Lactose 발효능이 없으므로 Coliform Group이 아님.

3. Endo Agar 결과
2. Eosin-Methylene Blue(EMB) Agar 결과
1) Endo Agar 조성의 역할

Lactose : 배지내 포함된 당 기질

Basic Fuchsin : 그람양성세균의 생장을 억제하는 염기성 염색 시약

Sodium Sulfite(Na₂S₂O₃) : 그람양성세균의 생장을 억제하는 물질.
Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) Broth 결과
Escherichia coli (EC) Broth 결과
Positive
(Durham Tube에 가스가 포집됨) : Presumptive Test에서 가스를 생성한 균은 Coliform group에 속함을 확인


Negative
(Durham Tube에 가스가 포집되지 않음) : Presumptive Test에서 가스를 생성한 균은 Coliform group이 아님
Positive
(Durham Tube에 가스가 포집됨): Presumptive Test에서 가스를 생성한 균은 Fecal coliform임을 확인

Negative
(Durham Tube에 가스가 포집되지 않음) :
Presumptive Test에서 가스를 생성한 균은 Fecal coliform이 아님
Confirmed test의 대장균 selective/differential media 상의 집락이 그람음성, 무아포성의 간균, 유당으로부터 gas를 발생 여부 재확인 시험

1) Lactose Broth 접종
: Durham tube내 가스 생성 여부 확인

2) NA slant 접종
: 균의 보관

3) Gram staining

4) IMViC Test, API kit Test
Gram staining
세균의 세포벽 구조 및 성분의 차이에 의해 그람양성세균과 그람음성세균으로 미생물들을 분류하고 구별하는 염색법

현미경 조사를 통해 Gram-negative 간균의 존재 확인을 통한 추가적인
coliform group
존재 확인
Gram staining 결과
IMViC Test (Q5)
대장균군 내에서 분변계의 대장균과 비분변계의 균 속을 구별하기 위한 실험

각 균들의 생화학적 특성과 특정한 기질에 대한 효소 반응을 근거로 하는 실험

Indole Test , Methyl Red Test, Vogues-Proskauer Test (VP test), Citrate Utilization Test 포함됨
1. Indole Test
미생물의 Tryptophan 가수분해 능력을 알아보고 Kovac's 시약 첨가를 통해 Indole의 생산 유무를 확인하는 시험

Tryptophan은 Tryptophanse에 의해 Indole로 전환

Kovac’s reagent 이용 (산성화된 buthanol과P-dimethylaminobenzaldehyde 포함)
2. Methyl Red Test
미생물의 Glucose 분해 결과 생성된 최종산물인 산의 생성 정도를 pH indicator 이용해 측정하는 시험

pH indicator로 Methyl Red 지시약 이용
(pH 4.4 이하에서 적색을 pH 6.2 이상에서 노란색을 나타냄)
3. Voges-Proskauer Test (VP test)
미생물의 Glucose 대사 결과 생성된 최종산물로서의 Acetoin(Acetylmethylcarbinol)을 검출하는 시험

Barritt’s reagent 이용 (Alcoholic alpha-naphthol 과 40% Potassium hydroxide solution 포함)
4. Citrate Utilization Test
미생물의 Citrate 분해 능력을 알아보는 시험

pH indicator로 Bromthymol blue (BTB)를 이용
(중성에서 초록색 pH 7.6 이상에서는 푸른색을 나타냄)
API kit Test
Biochemical Test, Assimilation Test, Fermentation Test를 이용한 동정법

1) Biochemical Test : saline 용액에 시험균을 현탁해 건조된 기질이 들어있는 kit의 capules에 접종하고 배양 후 발색시약 첨가를 통해 물질의 대사유무를 색의 변화로 판정

2) Assimilation Test : 최소배지에 현탁한 시험균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 kit의 capules에 접종하고 배양 후 탁도 변화를 통해 당의 이용여부를 판정

3) Fermentation Test : 당으로부터 산을 생산해 pH 변화로 판정하는 방법
API 20E kit
장내세균, 그람음성 간균의 동정

20종류의 Biochemical Test를 이용
Positive Negative
Positive

Negative
Positive
그람 음성 간균의 형태
대장균군은 사람이나 동물의 장관 내에서 병원균과 함께 존재함

물이나 식품에서 검출되면 분변오염의 증거가 될 뿐만 아니라 병원성균도 함께 존재할 가능성이 크므로 위생지표세균으로 선정

생균수는 균이 얼마만큼이 있는가는 알 수 있지만 병원성균의 존재여부는 알 수 없어 위생지표가 될 수 없음
1) 정성 검사에서, 각 희석단의 BGLB Broth 또는 EC Broth의 Positive를 보인 발효관의 개수를 각각 구한다. (일반적으로 시료가 10ml(고체는 g), 1ml, 0.1ml 들어간 희석단에서의 개수를 구함)

2) 통계표에서 결과와 같은 조건에서의 MPN Index Per 100ml(고체는 g)를 찾는다.
MPN Method 실험과정
위생지표세균
(Sanitary indicative bacteria)
위생적으로 지표가 되는 세균
<결과1> Lactose Broth에 시료(대연시장 순대) 접종 후 48시간 배양 결과
<결과3> 결과1에서 Positive를 나타낸 LB Broth를 BGLB Broth 접종 후 48시간 배양
<결과3> 결과1에서 Positive를 나타낸 LB Broth를 EC Broth 접종 후 24시간 배양
<결과4> 결과3에서 Positive를 나타낸 EC Broth를 EMB 접종 후 24시간 배양
<결과5> NA slant에서 형성된 colony의 Gram staining 후 현미경 관찰 사진 (현미경 ×400배율 관찰)
4. 분말상 : 멸균 도구로 잘 혼합한 후 일정량(10~25g)을 희석액과 혼합

5. 버터와 아이스크림류 : 40℃이하의 온탕에서 15분 내에 용해시켜 10g을 취한 후 희석액과 혼합

6. 캡슐제품류 : 캡슐을 포함하여 검체의 일정량(10~25g)을 취한 후 9배 양의 희석액과 균질화

7. 냉동식품류 : 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는대로 단시간 녹인 후 검체의 상태에 따라 위의 방법(1~6번과정)을 사용하여 채취
식품위생검사 시료 채취법
※Lactose를 분해, 산과 가스를 생성할 수 있는 균 : ‘대장균’(그람음성), ‘유산균’(그람양성)



유산균 배제를 위해 배지에 그람양성세균 억제 요소 포함
균질기의 종류
Waring Blender : 칼날이 날카로워 미생물 균체를 파괴시킬 수 있는 mixer기에 비해 철 구조의 무딘 칼날을 이용하여 세포의 손상을 줄여주는 균질기

Stomacher : 시료와 희석액을 stomacher bag에 넣고 혼합한 후 시료 내 균을 추출하기 위해 연동운동을 하여 균질화 시키는 기계
통계표
Negative
Q1- 식품(물) 중에서 대장균군실험을 하는이유?


식품의 취급 과정 중 직간접적으로 인축의 분변과 접촉하였을 경우 병원성균에 의해 오염될 수 있다. 이러한 오염의 지표로서 병원균과 항상 공존하는 대장균군을 검사함으로써 간접적으로 식품의 미생물학적 안정성을 확인할 수 있다
Medium : SIM agar

Substrate : Tryptophan
Medium : MR-VP broth

Substrate : Glucose
Medium : Simmons citrate

Substrate : Citrate
Medium : MR-VP broth

Substrate : Glucose
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