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Merino Booroola

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by

Rafael Hoyos Manchado

on 2 December 2013

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Transcript of Merino Booroola

Análisis de la secuencia BMPR-IB
3 hipótesis para explicar los dos alelos
Splicing alternativo

Cambios en la secuencia

Expresión diferencial
Una mutación en el receptor-IB de proteínas morfogénicas óseas, asociada al incremento en el ratio de ovulación en las ovejas Merino Booroola.
Análisis genético de la región FecB
Búsqueda de marcadores
Screening de 5 bibliotecas de YACs y BACs
Microsatélites del cromosoma 6 bovino
Secuencias correspondientes a genes localizados en el cromosoma humano 4q21-24
Selección de aquellos con fragmentos cercanos a la región de interés.
Búsqueda de marcadores (microsatélites y SNPs) con varios alelos.
Localización precisa del gen FecB
Análisis del ligamiento entre los marcadores y el gen FecB.
Estudio de 400 meiosis informativas, fruto de los cruzamientos entre hembras FecB+/FecB+ y machos heterocigotos FecB+/FecB
B
Determinación de la distancia en cM entre los marcadores y el gen FecB.
Hiperovulación por una mutación en el gen FecB
Introducción
Oveja Merino
Booroola

3 genotipos y 3 fenotipos
FecB+/FecB+ uno o dos óvulos (normal)
FecB /FecB+ tres o cuatro óvulos
FecB /FecB , cinco o más óvulos
B
B
B
Antecedentes

Análisis de ligamiento
Objetivo
Secuenciación y análisis del ARNm de BMPR-IB.

Sistema BMP expresado en ovarios de ratas y afecta a síntesis de esteroides en células granulosas.
Gen BMPR-IB candidato posicional para FecB.

Secuenciación y análisis del ARNm de BMPR-IB
Secuenciación y análisis del gen BMPR-IB
Objetivo: Determinar la secuencia de DNA genómico para BMPR-IB y estudiar el pratón de intrones-exones
Primers basados en humanos y ratones (genomas secuenciados)
2 BACs ovinos con FecB identificados anteriormente
PCR con primers internos
Secuenciación
Comparación secuencias de cDNA y DNA genómico de BMPR-IB ovino.
Existencia de 10 exones
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) entre secuencias cDNA/DNA ovino y humanos
Conservación total del patron intrón-exón en humanos y ovejas:
Búsqueda de la relación genotipo-fenotipo
93% identidad entre cDNA BMPR-IB ovino y humano
98% identidad secuencia aminoacídica predicha entre ovino y humano
Estudios in vitro
Metodología
Análisis y comparación de los alelos FecB y FecB+
Comparación secuencia DNA de los alelos de BMPR-IB
Diferencia entre FecBb y FecB+ por una transición A->G en posición 746: CAG->CGG
Mutación en la proteína: Q249R (sustitución de glutamina por arginina)
3 polimorfismos adicionales:

1 sustitución conservativa en la ORF
2 sustituciones en la región 3' unstranslated.
Explicación a nivel molecular del fenotipo Booroola partiendo del SNP hallado previamente
Estudios in silico
Conocimientos previos:
Métodos:
Secreción de progesterona
Radioinmunometría (RIA)
Radioisotopía (marcaje con 3H-timidina)
Proliferación celular del folículo

Ligandos del receptor y otras características fisiológicas
Resultados:
Secreción de progesterona
Proliferación celular
FecB está en el cromosoma 6

Entre los genes SPP1 y EGF

Homología con cromosoma 4 humano (regiones ortólogas)
Métodos usados en el presente estudio
Laparoscopia
Estudio del efecto de ligandos según genotipo
Secuenciación y análisis del gen BMPR-IB:
estudio intrones-exones.
Análisis y comparación de los alelos de BMPR-IB
El genotipo de Booroola se asocia a menor proliferación de células foliculares
Los ligandos GDF-5 y BMP-4 no alteran diferencialmente la proliferación celular.
Localización exacta de FecB y correspondencia con dos genes: BMPR-IB y UNC5C.
Los ligandos GDF-5 y BMP-4 inhiben la secreción de progesterona según la dosis aplicada
La tasa de inhibición no se ve alterada por FSH
Genotipación de los polimorfismos por análisis conformacional de cadena simple (single-strand conformation analysis)
Transición A->G responsable de los alelos FecBb y FecB+ :
249R: presente en todas las ovejas Booroola Merino.
249Q: presente en todas las wild type (no Booroola)..
No hay relación entre la distribución de los tres polimorfismos adicionales y el fenotipo Booroola.
Transición en FecB (A->G en posición 746) responsables del fenotipo Booroola
No hay splicing alternativo
Extracción ARNm de células granulosas FecBb/FecBb y FecB+/FecB+
Retrotranscripción a cDNA
Amplificación del cDNA
Secuenciación de alelos FecBb y FecB+.
BACs que contienen FecB
2 alelos: contienen la sustitución A->G
Marcador OB2:
El efecto de BMP-4 es mayor
Hay diferencias significativas en la inhibición según el genotipo: menor en Booroola.
Conclusión:
Identificación de la proteína codificada por el gen FecB
¿
?
El fenotipo no es consecuencia de una expresión diferente y se da en el mismo tipo de células
Hipótesis sobre el gen FecB
Confirmación del gen BMPR-IB como candidato para FecB
EL CAMBIO EN LA SECUENCIA DISMINUYE LA ACTIVIDAD DEL RECEPTOR
Conocimientos previos:

Estructura cristalizada de una proteína paráloga unida a un ligando (FKBP12)
Existencia de proteínas con secuencia y estructura similar (familia TBR-I)
Confirmación del gen BMPR-IB como FecB
Métodos:
Aplicaciones biotecnológicas
Utilización de ligandos antagonistas de BMPR-IB como inductores de fenotipo Booroola en ovejas FecB+/FecB+
Búsqueda en UniProt de otros mutantes en BMPR-IB
Asociar mediante SwissModel la estructura de TBR-I/FKBP12 con BMPR-IB
Simular la mutación y estudiar la interacción con el ligando FKBP12
BACs que contienen FecB
2 alelos: contienen la sustitución A->G
Marcador OB2:
Discusión:
El residuo implicado no forma parte del sitio activo, pero se localiza en una región fundamental para que se produzca actividad cinasa
Un cambio de Q por R permite un puente de hidrógeno fuerte entre FKBP12 y la BMPRIB, y es estabilizado por una nube electrónica de residuos cercanos (electrones pi)
Futuros experimentos:
RELACIÓN FKBP12 y BMPR-IB
Mediante un Blast, comprobamos que BMPR-IB es una proteína altamente conservada, con la misma secuencia y longitud al menos en mamíferos (p.e. con Homo sapiens tiene una identidad del 98.0 %).

No se han descrito mutaciones similares con cambios en la tasa de ovulación, excepto en cerdos. En humanos mutaciones en BMPR-IB puede dar lugar a braquidactilia. En general, hay pocos datos al respecto.

No podemos descartar que la misma mutación en otras especies produzca fenotipos similares a Boooroola.
Mutación Q249R
Una alternativa a la obtención de mutantes como Booroola sería la de administrar a individuos wt antagonistas de BMPR-IB, de manera que se indujera el fenotipo Booroola. Habría que realizar un estudio ¿técnico y económico?
Identificación unívoca del alelo Booroola
Objetivo: conocer secuencia del ARNm ovino de BMPR-IB
Estudio estadístico
Secuenciación
PCR
BLAST
Análisis conformacional de cadena simple
Radioinmunometría
Análisis in silico
RT-PCR
B
Beh!
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