Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Sekwencjonowanie DNA

No description
by

Paulina Pełka

on 27 December 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie DNA
Metoda Sangera
ETAPY:
1.Preparatywny PCR –
otrzymanie homogennego DNA
2.Oczyszczenie produktu PCR i denaturacja – otrzymanie jednoniciowej matrycy
3.Synteza nowych nici
z użyciem dNTP i ddNTP
4.Elektroforeza w warunkach denaturujących.
5.Analiza prążków.

Historia polimerazy
fragment Klenowa polimerazy DNA



polimeraza faga T7



polimeraza Taq z mutacją (reszty fenyloalaniny zamienione na tyrozynę)
Cel sekwencjonowania
Trochę historii
Nukleotydy
Istotne elementy dla sekwencjonowania DNA
1869 - Friedrich Miescher
1953 - James Watson, Francis Crick
1977 - Allan Maxam i Walter Gilbert oraz Fred Sanger
1980 - Nobel dla Waltera Gilberta i Freda Sangera
2001, 15 i 16 lutego - opublikowanie sekwencji ludzkiego genomu
wiazanie N-glikozydowe
grupy hydroksylowe
właściwości nukleotydów
Bibliografia
Rodney E. Shackelford, D.O., Ph.D., Tulane university,(c) 2008-2011,
,http://laboratoria.net/pl/artykul/Metody%20sekwencjonowania%20DNA;12972.html
Robert K. Murray (red.): Biochemia Harpera. Warszawa: PZWL, 2005.
Tabor S.,Richadson C, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 6339-6343, July 1995
http://www.biotechnolog.pl/pirosekwencjonowanie-sekwencjonowanie-z-wykorzystaniem-kwantow-swiatla
http://www.youtube .com/watch?v=nFfgWGFe0aA
http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Pirosekwencjonowanie/
http://genomenewsnetwork.org
Discovering Genomics, Proteomics and Bioinformatics - A. Malcolm Campbell, Laurie Heyer
http://www.bio.perlan.com.pl/Kategorie/Sekwencjonowanie/Haloplex/
http://www.molecularcloning.com
http://illumina.com
dostarczenie wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów
znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów ich funkcjonowania i ewolucji
umożliwienie szukanie mutacji
Pierwsze metody
Maxam i Gilbert - metoda chemicznej degradacji łańcucha DNA
Sanger - metoda terminacji łańcucha
Przygotowanie martycy
DNA amplifikowane za pomoca PCR
Dla sekwencji, do których nie posiadamy starterów:
geny wklonowane w wektory plazmidowe
geny wklonowane w wektory bakteriofagowe (np. M13) - do 25kpz
Dla fragmentów dla których znamy sekwencje starterów:
Usunięcie pozostałych starterów i dNTP po PCR
Metoda 1: elektroforeza (1,5% agaroza) + GelOut

Metoda 2: egzonukleaza I + SAP
Mieszanina reakcyjna
matrycowy DNA (produkt PCR)
startery
polimeraza (faga T7 lub
Taq
)
bufor, Mg2+
dNTP
+ dideoksynukleotydy:
ddATP/ddTTP/ddCPT/ddGTP
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter15/animation_quiz_1.html
Odczytanie sekwencji
Metoda
Maxama i Gilberta
Rzadko stosowana ze względu na
trudność
wysoki koszt
sekwencjonowanie krótkich framentów
Matryca to dsDNA lub ssDNA znakowany na końcu 5':
izotopowo, fosforem 32P
streptawidyną
biotyną
fluorescencyjnie
Procedura
1. Modyfikacja zasady azotowej
2.Usunięcie zasady azotowej
3.Przecięcie łańcucha w miejscu AP

4 reakcje
G
G+A
T+C
T
Reakcja G
SIARCZAN DIMETYLU(SDM) - modyfikacja guaniny przez metylację w pozycji N7(powoduje osłabienie wiązania N-glikozydowego)
PIPERYDYNA - usunięcie zmodyfikowanej zasady i przecięcie łańcucha przed miejscem jej usunięcia(3')

Reakcja G+A
SDM + KWAS MRÓWKOWY - modyfikacja guaniny i adeniny
PIPERYDYNA
Reakcja T+C
HYDRAZYNA- modyfikacja zasad przez rozszczepienie pierścieni pirymidin (tymina,cytozyna)
PIPERYDYNA
Reakcja T
HYDRAZYNA + CHLOREK SODU - modyfikacja jedynie tyminy
PIPERYDYNA
Wyniki
pula fragmentów DNA o jednakowym końcu 5' (ze znacznikiem)
znany ostatni nukleotyd (usunięty) w każdej z 4 reakcji
przeprowadzenie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (warunki denaturujace)
PIROSEKWENCJONOWANIE
Metoda opracowana w 1996 roku przez prof. Pala Nyrena oraz jego ucznia Mostafę Ronaghiego z Royal Institute of Technology w Sztokholmie.
Wykorzystuje ona enzymatyczną reakcję chemiluminescencji do poznania sekwencji nukleotydowej interesujących nas genów w czasie rzeczywistym.
NIEZBĘDNE SKŁADNIKI DO PIROSEKWECNJONOWANIA:
Matryca w postaci jednoniciowego DNA

ENZYMY:
Polimeraza DNA - fragment Klenova polimerazy I z
E.coli
Sulfurylaza ATP - izolowana z bakterii
Aquifex pyrophilius
Lucyferaza - pochodzi od świetlika
Photinus pyralis
Apyraza - izolowana z ziemniaka (
Symphytum tuberosum
)

SUBSTRATY
dNTPs
lucyferyna
APS - adenozynofosfosiarczan
ETAPY:
1. Przygotowanie matrycy


1. Przygotowanie matrycy
A. Amplifikacja fragmentu DNA
do sekwencjonowania w reakcji PCR - ważne jest użycie jednego ze starterów znakowanego biotyną

B. Separacja jednoniciowych odcinków DNA:
użycie urządzenia zasycającego - złoże sefarozy opłaszczonej streptawidyną
wiązanie biotyny z streptawidyną
denaturacja oraz odpłukiwanie
uwolnienie powstałych matryc ze złoża
- użycie płytki z roztworem starterów sekwencyjnych
- ogrzanie płytki do 90°C a następnie ochłodzenie do 45°C - związanie matrycy z starterami

C. Umieszczenie przygotowanej płytki w sekwentatorze

2. Polimeryzacja nici DNA
2.Polimeryzacja nici DNA
SEKWENATOR
Należy uzupełnić dozowniki reagentami
dodanie dNTPs - jednego z czterech np dCTP
wbudowanie komplementarnego nukleotydu za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I
- zapobiega niesynchronicznej polimeryzacji DNA

- brak aktywności egzonukleazowej 5’->3’

- brak aktywności egzonukleazowej 3’->5’ (dzięki mutacji)
(DNA)n + dNTP -> (DNA)n+1 + PPi
3. Produkcja ATP z PPi
PPi + APS -> ATP + H2SO4
3.Produkcja ATP
Sekwencjonowanie genomów
Reakcja katalizowana przez sulfurylazę ATP
1. Metoda "shotgun"
2. BAC-to-BAC
3. Metody nowej generacji

Shotgun
losowo pocięte fragmenty DNA 2kbp
konstrukcja bibliotek plazmidowych
- niezbędne są jony magnezowe
BAC-to-BAC
fragmenty DNA - 150kbp
konstrukcja bibliotek BAC, a następnie bibliotek M13
tworzenie map przed sekwencjonowaniem
Metody nowej generacji
Bardzo krótkie fragmenty DNA (450bp-50bp)
454, 2005r.
Solex (Illumina), 2006r.
SOLiD, 2007r
Solex (Illumina)
adenozynofosfosiarczan
Terminator znakowany fluorescencyjnie wbudowywany podczas
syntezy
nici DNA.
- każdy z 4 nukleotydów oznaczany jest innym znacznikiem fluorescencyjnym
- na podłożu stałym
Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection
SOLiD
- oparte na ligacji
1. Losowa fragmentacja DNA.
2. Amplifikacja za pomoca PCR.
3. Koniec 3’ podłączany do stałego podłoża.
4. Za pomocą ligacji dołączane są znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy
Sekwencjonowanie z wykorzystaniem sond
Haloplex
4.Konwersja lucyferyny do oksolucyferyny z wytworzeniem kwantu światła
5’ –RACE
5.Degradacja nieprzyłączonych dNTPs oraz nadmiaru ATP
powstawanie cDNA z mRNA przy pomocy odwrotnej transkryptazy
synteza drugiej nici cDNA i PCR z użyciem GSP (gene specific primer)

6. Detekcja fotonów w celu utowrzenia pyrogramu
4. Wytworzenie strumienia fotonów
A. Przekształcenie lucyferyny w lucyferylo-AMP
z użyciem ATP
lucyferaza + lucyferyna + ATP -> lucyferaza◦lucyferylo-AMP + PPi
- reakcja katalizowana przez
lucyferazę
B. Utlenienie związanej lucyferyny

lucyferaza◦lucyferylo-AMP + O2 -> lucyferaza + oksylucyferyna + AMP + hv
- 2 Base Color codes

- powstaje oksylucyferyna w stanie wzbudzonym, która przechodząc w stan podstawowy emituje strumień fotonów
Degradacja dNTPs oraz ATP





Nadmiar ATP oraz nieprzereagowane dNTPs ulegają reakcji odłączenia reszt fosforanowych

Reakcja katalizowana przez enzym - Apirazę

Obecność powstałych monofosforanów nie zakłóca przebiegu dalszych procesów

Po zakończeniu degradacji można dodawać kolejne nukleotydy
ATP -> AMP + 2Pi
Detekcja strumienia fotonów
1 pmol DNA - 6 x 10 cz. ATP - 6 x 10 fotonów
9
11
Wykrywanie błysków przez fotodiodę, fotopowielacz lub też układ elementów światłoczułych zwany matrycą CCD
utrwalenie na wykresie zwanym pyrogramem

Wysokość i ilość pików jest proporcjonalna do liczby przyłączonych nukleotydów, a ich kolejność pozwala bezpośrednio odczytać sekwencję powstającej nici.
Zalety pirosekwencjonowania
Czułość - analiza występujących mutacji punktowych obejmujących zmianę tylko jednego nukleotydu.

Specyficzność - dzięki zastosowaniu reakcji PCR oraz znakowania biotyną starterów, próbka podlegająca sekwencjonowaniu zawiera tylko i wyłącznie badany fragment DNA.

Redukcja kosztów

Automatyzacja - cała procedura sekwencjonowania wykonywana jest przez urządzenie.

Szybkość analizy

Ilościowa korelacja


Sekwencjonowanie automatyczne
opiera się na metodzie terminacji łańcucha
używa się dideoksyrybonukleotydów, wyznakowanych fluorescencyjnie
każdy ddNTPs zawiera inny fluorochrom o oddmienych długościach fal emisji
umożliwia przeprowadzenie tylko jednej reakcji z użyciem wszystkich ddNTPs naraz
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym przeprwowadzana jest w jednej ścieżce
Sekwencja odczytywana przez detektor w trakcie przesuwania prążków - czas rzeczywysty
Zalety sekwencjonowania automatycznego
Szybkość- sekwencja odczytywana przez detektor w trakcie trwania rozdziału
Eliminacja błędów ludzkich- wyniki są odczytywane przez detektor i zapisywane w pamięci komputera
Brak znaczników radioaktywnych
Znaczne podniesienie wydajności- proces przygotowania reakcji i nanoszenia próbki na żel też jest zautomatyzowany
Full transcript