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SECUENCIACION.

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by

Ginneth Herrera

on 23 May 2015

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Transcript of SECUENCIACION.

SECUENCIACION.
METODOS DE AMPLIFICACION.
Las tecnicas de amplificacion copian fragmentos de los ac nucleicos de un microorganismo y permite que sean detectados. (Prats G., 2006)
El método de degradación química (Maxam and Gilbert, 1977).
El método enzimático (Sanger et al., 1977).
AVANCES QUE HAN PERMITIDO EL DESARROLLO DE METODOS PARA LA SECUENCIACION.
Automatización del método de Sanger
INTRODUCCION.
No es difícil imaginar que la posibilidad de multiplicar en serie el número de copias de un fragmento de DNA del genoma de un microorganismo, sería de gran utilidad para cualquier tipo de estudio o manipulación de ese fragmento. Esto se puede conseguirse mediante las técnicas de amplificación. Algunas de estas técnicas permiten amplificar el RNA a través de su conversión en DNA complementario. (cDNA) mediante una transcriptasa inversa, el fragmento amplificado se denomina diana.
SECUENCIA DE UN FRAGMENTO
Se denomina secuencia de un fragmento de DNA al orden en que están dispuestas las bases en ese fragmento. Por ejemplo la frecuencia de un fragmento puede ser 5’-AATGCAGGTATGCC-3’ y la de otro 5’-GATCCGTTTAGCCAT-3’. (Prats G., 2006)
SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS.
Este metodo molecular permite explicar y aclarar una parte de la secuencia genomica.
La estrategia básica de la secuenciación de ácidos nucleicos

1.- La degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos en estudio a fragmentos muy pequeños.

2.- La secuenciación de los fragmentos pequeños.

3.- El ordenamiento de los fragmentos a través de la repetición de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradación.

(Forbes B., 2009)
La técnica de PCR y su relevancia en la secuenciación de ADN
SONDAS DEL DNA DE ALTA DENSIDAD.
SECUENCIACION POR SINTESIS (PIROSECUENCIACION)
Este metodo permite la amplificación exponencial de una molécula de ADN, generando millones de copias de un fragmento.
Chromosome Walking
Shotgun Sequencing.

EL PROYECTO DEL GENOMA HUMANO ESPERA MEJORAR LAS VIDAS SECUENCIANDO EL GENOMA.
ESTRATEGIAS PARA SECUENCIACION DE FRAGMENTOS GRANDES DE ADN Y EL PROYECTO DEL GENOMA HUMANO.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS.
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE.

SECUENCIACION DE AC. NUCLEICOS.

INTEGRANTES:

Herrera Ramírez Ginneth 20132180036




Estructura del ADN. (Prats G., 2006)
Ademas proporciona informacion que nos ayuda a detectar, identificar y caracterizar microorganismo
Secuenciacion en geles que consiste en una serie de sondas de oligonucleotidos de alta densidad, que se basa en la hibridacion de un ac. nucleico dianamarcado con unos compuestos fluorescentes.
(Bety A., 2009)
La Secuenciación por síntesis, se basa en la incorporación de nucleótidos en la hebra de DNA amplificada por PCR, luego se genera pirofosfato que produce luz a travez de reacciones enzimáticas y así se determina la secuencia.
La secuenciación se hace a partir de fragmentos al azar. Después, se utiliza un programa de cómputo para encontrar las regiones que se traslapan entre las secuencias individuales. Así se va ensamblando la secuencia del fragmento original (Brown, 1999).
El PGH trata con el descubrimiento y la secuenciación del complemento completo de ADN de una célula somática humana. Su meta principal es una lista y localización de nuestros genes
Las herramientas de análisis computarizado diseñadas específicamente para entender el significado de la secuencia de bases en esta gran macromolécula han ayudado tremendamente al Proyecto del Genoma Humano
¿De qué nos sirve la información de la secuencia de un genoma?
a) Mejorar la infraestructura de la investigación genética

b) Comparar el papel de una secuencia de ADN en los humanos y en los organismos modelo

c) Mejorar la bioquímica analítica del ADN

Equipo

• Espectrofotómetro
• Termocicladora (PCR)
• Vortex
• Refrigerador 4 °C
• Centrífuga para microtubos de 1.5 ml
• Concentrador de vacío
• Secuenciador automatizado ABI PRISM 3100

Material

• Juego de micropipetas
• Gradillas para microtubos
• Microtubos de 1.5 ml.
• Microtubos para PCR
• Puntas para micropipetas de 10, 200 y 1000 µl
• Columnas Centrisep
• Placas de 96 pozos para secuenciador 3100 AB
• Tapas para placas de 96 pozos
• Base para placas de 96 pozos
• Juego de 4 capilares para secuenciador 3100
• Plumones indelebles

Reactivos

• Big dye terminator V3.0 Applied Biosystems
• Buffer
• Agua grado biología molecular
• Templado de DNA
• Iniciadores para la región a secuenciar 10 pmol/µl
• Formamida Hi Di (CAS N°75-12-7)
• Polímero para secuenciador AB 3100 POP6

PROTOCOLO EN EL LABORATORIO.
HISTORIA
En abril de 1953, dos científicos estadounidenses, James D. Watson y Francis Crick, vieron la estructura del ADN como una escalera en caracol, contruidas con pares de moleculas llamadas bases.
Después de 1975, se realizó un progreso dramático en la tecnología de
la secuenciación de los ácidos nucleicos.

1. El descubrimiento de las endonucleasas de restricción, enzimás que
cortan ADN de cadena doble en secuencias específicas.

2. El desarrollo de mejores técnicas de secuenciación de ADN.

3. El desarrollo de técnicas de clonación que permitieron la adquisición
de un segm ento de ADN en las cantidades necesarias para secuenciarlo.


- Detectar y clasificar patógenos humanos, antes desconocidos.

- Hacer analisis de mutaciones geneticas.

- Observar los cambios de los nucleotidos resultantes de mutaciones y determinar su resistencia a los antibioticos.

- Establecer el parentesco entre aislamiento de la misma especie.

(Forbes B., 2009)

Las secuencias de nucleótidos obtenidas de un microorganismo pueden dar una base de datos para:

• Voet D., Voet J., Bioquimica 3ra Edicion., Editorial panamericana. Buenos Aires (2006).
• Voet D., Voet J., Pratt W., Fundamentos de Bioquimica, la vida a nivel molecular, 2da Edicion., Editorial Medica Panamericana. Madrid España (2007).
• Forbes B., Diagnostico Microbiológico. 12va Edicion. Editorial Medica Panamericana. Madrid España (2009).
• Davidson R., Bioquimica de los Acidos Nucleicos., Editorial Revete., Barcelona (1980).
• El Proyecto del Genoma Humano: Una Revisión Científica y Ética. http://www.actionbioscience.org/esp/genomica/carroll_ciaffa.html
• La secuenciación de ácidos nucleicos: una carrera contrarreloj. http://www.sebbm.es/ES/divulgacion-ciencia-para-todos_10/la-secuenciacion-de-acidos-nucleicos-una-carrera-contrarreloj_276
• Secuenciación de fragmentos de ADN. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/secuenciacion.pdf

BIBLIOGRAFIA.
A finales de los 70 se empiezan a desarrolar metodos para la secuenciacion de ADN.

Metodos desarrollados por Allan Maxan, Walter Gilbert y Fred Sanger.
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