Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Otimização de produção, purificação e caracterização parcial de lipases produzidas pela levedura Monilielia spathulata R25L270

Felipe Tadeu Fiorini Gomide - Mestrando em Bioquímica e Imunologia. LEFQP
by

Felipe Gomide

on 10 August 2012

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Otimização de produção, purificação e caracterização parcial de lipases produzidas pela levedura Monilielia spathulata R25L270

Alto custo matéria prima (óleos/gorduras)
Remoção água (óleo + álcool) sabão (Vasudevan, 2008)
Reação com FFA (free fatty acid) e TAG (triacylglicerol) (Fjerbaeck,2009)
Lavagem glicerol e biodiesel 0,2ton H O/ ton biodiesel (Fjerbaeck,2009)
Otimização de produção, purificação e caracterização parcial de lipases produzidas pela levedura Moniliela spathulata R25L270
Felipe Tadeu Fiorini Gomide
Problema
Busca das variáveis influenciáveis
Busca das melhores condições
Grande número de variáveis INDEPENDENTES
Cada variável opera em níveis distintos
Exemplo
Caracterização enzimas
Outros fatores
Tipo solventes
Tempo exposicao
Cofatores
Tipo substratos
Tipo inibidores
Excipientes
pH
temperatura
tempo de incubação
Teste simultâneo.
Acessar efeitos de combinação.
Minimizar experimentos.
Avaliar erro da estratégia experimental.
Número de experimentos necessários para uma caracterização ampla e a busca da melhor condição de uma enzima através do emprego de diferentes delineamentos.
Tipo solventes
Tempo exposição
Cofatores
Tipo substratos
Tipo inibidores
Excipientes
Temperatura
pH
Tempo de incubação
Solvente
Substrato
pH
Tempo incubação
Temperatura
~5 níveis
p/ cada
=
13
testes
Melhor condição
Primeira abordagem:
um fator por vez
Condições
Efeitos de interação entre as variáveis não são acessados
SIM!
Segunda abordagem:
combinando os fatores
125 testes
explora todo o espaço experimental, porém...
E se um ou mais dos fatores testados não influenciarem na resposta a ser otimizada?
Grande trabalho

Sem resultados úteis
E se existisse uma forma de verificar previamente os fatores que influenciam na resposta antes de serem testados os seus níveis?
Metodologia de Superfície de Respostas
Identifica efeitos
Muito menos tratamentos para acessar a resposta
Permite ser acessado o erro do planejamento adotado
Exemplo de teste:
3 variáveis com 5 níveis
variáveis x níveis - (variáveis-1)
3*5-(3-1) = 15-2
8 ensaios fatoriais (vértices) -> principais
6 pontos axiais -> interação
3 ensaios no ponto central -> erro
Entendi, o sistema funciona, mas....
Por onde e como começar?
Variáveis quantitativas
Fatorial fracionado ou Placket-Burman
Obtenção dos contornos
ETAPAS
Seleção de variáveis teste (independentes)
Seleção das variáveis resposta
Otimização
Deslocamento ascendente
Validação
13*3 (triplicata) = 39 testes
screening = significância 10% (p<0,1)
analisar as respostas
Realizar a ANOVA (análise de variância) para calcular o ajuste do modelo
Região de operacionalidade ou inicio do teste
Determinação das variáveis significativas
Deslocamento ascendente/DCCR/Relatório
Designing...
Entendendo os efeitos de
primeira e segunda ordem
Triplicata?
!
primeira ordem
temperatura +
concentração % -
catalisador +-
Segunda ordem
Temp x Catalis = TK
Bibliografia
Box, George E. P. Statistics for experimenters: design, discovery, and innovation, John Wiley & Sons, Inc. 2nd ed.
Rodrigues, M. I. Planejamento fatorial e otimização de processos. 2a edição Campinas, 2009
Montgomery, D. C. Introduction to statistical quality of control, John Wiley & Sons, Inc. 2nd ed.
Problema
Tendências com o atual modelo energético
Demanda cresce 1,5%/ano / 40% até 2030
Níveis atmosféricos CO2-e ultrapassaram 450ppm [1]
11/20 (1995/2006) - recordes temperatura superficial [3]
[1] Schenk, P. M., Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production, Bioenerg. Res. (2008) 1:20–43
[2] Cox, P.M., Et. Al., Acceleration of global warming due to carbon-cycle feedbacks in a coupled climate model, The Warming Papers, (2011)
[3] Contribution of Working Groups I, II and III to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change
- Core Writing Team, Pachauri, R.K. and Reisinger, A. (Eds.) IPCC, Geneva, Switzerland. pp 104
[4] Thomas, C.D., Et. Al. Extinction risk from climate change, Nature 427, 145-148 (2004).
[5] Vasudevan, P. T., Et. Al. ; Biodiesel production—current state of the art and challenges; Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology; V 35, N5, (2008)
Metade do CO2 emitido é absorvido pelos ecossistemas [2]
Licenciado em Ciencias Biológicas
Mestrando em Bioquímica e Imunologia
Orientador: Marcelo Matos Santoro
Co-orientadora: Vera Lúcia dos Santos
Laboratório de Enzimologia e Físico-química de Proteínas - N4(112)
15-37% ssp de regiões de 20% do planeta em um cenário de médio risco tendem a ser ameaçadas de extinção [4]
Biocombustíveis
1,27 tri barris / 6,1 tri m³ gas (85 mi/dia - 260 bi m³/dia) -> 40a oleo/ 64a gás [5]
Fontes renováveis de energia
CO2 emitidos -> 0 (sequestro CO2)
Disponibilidade/eficiência
tecnologias
Uso/investimentos
Biocombustíveis de segunda geração: 2020 [1]
[1] World Energy Outlook 2009 - International Energy Agency Press, 2009
Biodiesel
Modificação motores/transporte/armazenamento 0
Melhor lubrificante
Maior ponto de fulgor segurança/estabilidade
Menores emissões dióxido de carbono
Desafios (rentabilidade)
A review of the current state of biodiesel production using enzymatic transesterification. Biotech & bioeng, 102, n5, (2009).
Catálise enzimática (Fjerbaek,2009)
Altas variações (óleos)
Reutilizáveis
Menos etapas
Menor energia
Menor água residual
Vantagens
Desvantagens
Menor taxa de reação
Custo maior (1000US$/kg Lipase 0,62US$/kg NaOH)
Perda de atividade
Otimização da produção de lipase
Fisiologia microbiana complexa
Resultados de Atividade

Densidade celular (Abs 600nm)
Atividade lipásica (pNPP)
Dosagem proteínas (Lowry)
pH
ativação em ágar Sabouraud
inóculo 0,01Abs em 600 nm
meio líquido
180 rpm
28 ºC
Melhor atividade independente dia
Densidade celular para sétimo dia de cultivo
Atividade normalizada para proteína
Atividade normalizada para proteína 7º dia
Fonte de C
Fonte de N
[C]
Fosfato de Potássio
pH
Gráficos de contornos das variáveis na resposta
Fatorial fracionado para as duas fontes de carbono
Purificação da lipase
Rastreamento pelas atividades das frações
Gel filtração
Troca catiônica
Troca aniônica
Fase reversa
Precipitação com sulfato de amônio
80%
2/3/4
10/11
2-7
mono-S
mono-Q
mono-Q
Superose 12
Superose 12
Tris-HCl 25mM
pH 8.0
1mL/min
10/11
2/3
aquapore RP300
aquapore RP300
Diálise
Tris-HCl 25mM
+1M NaCl
pH 8.0
1mL/min
Precipitação NH4SO4
GN6
GN8
ON6
ON8
Superose 12
Tris-HCl 25mM
pH 8.0
1mL/min
2/3
4/5/6
10/11
Troca Iônica
Mono Q
Tris-HCl 50mM
+ 1M NaCl
pH 8.0
1mL/min
Perda considerável de atividade das frações de 80% de saturação
Ineficiência da metodologia
Coluna heparina
0.5mL/min
Ineficiência da metodologia
Etapa adicional - Fase reversa
Fase B: MeOH

0-10min: 0%B
10-40min: 0-80%B
40-42min: 80-100%B
1.0mL/min
Aquapore RP
depleção atividade
30min incubação
Nova estratégia
Precipitação sulf. Amônio
Membrana Amicon 10KDa
Eletroeluição
Gel nativo
Combinação de estratégias funcionais
Cultivo
Precipitação sulfato de amônio
Membrana Amicon (30kDa)
Gel filtração
60%
80%
superose 12
Tris-HCl
pH 8.0
1.0mL/min
80%
60%
NaAc 25mM
+1M NaCl
pH 5.0
1mL/min
FaseB: ACN
0-100:10-40 min
1mL/min
nitrato de amônio 0,1%
Fosfato de potássio 0,1%
Sulfato de Magnésio 0,05%
Peptona 2,0%
Fonte C 1,0%
180rpm
28ºC
Recordes de temperatura superficial [3]
Problema
Tendências do atual modelo energético
Demanda de petróleo cresce 1,5%/ano / 40% até 2030 (WEO,2009)
Níveis atmosféricos CO -e ultrapassaram 450ppm (Schenk, 2008)
40 anos óleo/ 64 anos gás (Vasudevan, 2008)
Recordes de temperatura superficial (IPCC, 2009)
Biocombustíveis
Mercado
Custo de produção (petróleo)
Produção
Níveis de mistura nos combustíveis.
Disponibilidade/eficiência
tecnologias
Uso/investimentos
OTIMIZAÇÃO PARA MULTIPLAS RESPOSTAS
Levedura
13 testes

39 testes
triplicata
375 testes
triplicata
Teste simultâneo com múltiplas combinações
variáveis
combinação das variáveis
níveis
Metodologia de Superfície de Respostas
17 ensaios!
+
Estimativa do erro do planejamento
Determinação de Variáveis
grande variação
dentro do espaço amostral
Analise por método Taguchi (Minitab 16®)
Maior capacidade
de catálise do biodíesel
reação com 90mM pNPP
a 37ºC
Sobrenadantes centrifugados
6000g/5min
Purificações subsequentes
Vasudevan, P. T., Et. Al. ; Biodiesel production—current state of the art and challenges; Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology; V 35, N5, (2008)
Contribution of Working Groups I, II and III to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change - Core Writing Team, Pachauri, R.K. and Reisinger, A. (Eds.) IPCC, Geneva, Switzerland. pp 104
Fjerbaek, L., Et. Al. - A Review of the Current State of Biodiesel Production Using Enzymatic Transesterification, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 102, No. 5, April 1, 2009
Schenk, P. M., Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production, Bioenerg. Res. (2008) 1:20–43
Conclusões
O design de níveis mistos e fatorial fracionado acessou as variáveis que mais influenciam na produção de lipase de Moniliella spathulata R25L270 requerendo menos testes, subsidiando novos experimentos.
Provavelmente, a levedura de estudo produz pelo menos duas lipases distintas com diferentes atividades para pH, temperatura, cátions e substratos.
As técnicas de:
precipitação com sulfato de amônio
ultrafiltração em membana Amicon® de 30KDa
cromatografia de gel filtração em Superose12
são eficientes para purificar parcialmente as enzimas da levedura.
TAGUCHI -
DESIGN DE NÍVEIS MISTOS
Grande dependência energética do petróleo (1/3) (Oliveira & Franca, 2009).

Determinar as principais variáveis e seus níveis que influenciam na produção de lipase por Moniliella spathulata R25L270, além de executar a purificação cromatográfica parcial da enzima e caracterização das frações recolhidas.
Objetivo Geral

Otimizar as condições de cultivo de M. spathulata R25L270 para crescimento e
produção de enzimas lipases;
compostos emulsificantes,
usando o delineamento fatorial de níveis mistos, variando-se:
pH;
concentração de fosfato;
fontes de carbono;
concentração das fontes de carbono;
fontes de nitrogênio;
concentração das fontes de nitrogênio.
Projeto de Mestrado
LMA
189 isolados
M. spathulata
Lipase
DEFESA DE DISSERTAÇÃO
Otimização
Purificação
Cromatografia
ATPS
Caracterização
Padronizar condições de purificação cromatográfica da lipase de Moniliella spathulata R25L270.
Identificar a influência que as fontes de carbono no meio de cultivo exercem no padrão de produção de lipases secretadas pela levedura Moniliella spathulata R25L270 através de técnicas de purificação a partir das frações advindas de cada cultivo.
Purificar parcialmente a lipase através das melhores condições de purificação prestabelecidas utilizando a levedura cultivada em meio de cultura com a fonte de carbono que apresentou produção mais elevada da enzima.
Caracterizar as frações purificadas frente à diferentes temperaturas, substratos, cátions e pH.
Padronizar e determinar e as condições de operação do sistema de extração líquido-líquido para a lipase comercial de Candida rugosa em caráter preliminar para aplicação do sistema com a enzima de Moniliella spathulata R25L270
Objetivos específicos
Concentrações de nutrientes (2 ou mais).
Tipos de nutrientes (2 ou mais)
combinação de fatores com dois níveis com fatores com três ou mais níveis em um mesmo delineamento
DETERMINAÇÃO DOS FATORES
TAGUCHI -
DESIGN DE NÍVEIS MISTOS
Combinação de fatores com dois níveis com fatores com três ou mais níveis em um mesmo delineamento
Otimização de cultivo
DETERMINAÇÃO DOS FATORES
Monitoramento diário (7 dias)
Variáveis e níveis de teste
Delineamento
Preparação da cultura e leitura
Otimização de cultivo
Efeito das variáveis nos níveis estudados
Coeficiente
de determinação
R-Sq = 67,5 %
menor influência na variação dos resultados sobre a média
Gráfico de efeitos dos níves das variáveis na média de atividade
menos significativa para explicar a variação dos dados sobre a média
pH
Obtenção de informações sobre o metabolismo de Moniliela spathulata
Analisar as outras respostas
A concentração da fonte de nitrogênio foi menos significativa para explicar a variação dos dados sobre a média
Eficiência de produção celular
grande variação
dentro do espaço amostral
a variação do pH interferiu positivamente na atividade normalizada de proteínas
Manutenção das variáveis mais significativas
Tomada de decisão
Exclusão da variável fonte de nitrogênio
Otimização para óleo de oliva
Atividade (U.L .s )= 73,23 -6,59 i -13,81 j
-1
-1
Otimização para glicerol
i = pH
j= concentração do sal de fosfato
Efeitos de interação entre as variáveis
alto ajuste do modelo
Atividade (U.L .s )=
0,290 -0,124 k +0,048 l -0,128 m +0,114 n +0,062 o
4
4
4
-1
-1
não se reproduziu
Perda quase total da atividade
MALDI
sem ionização
Alfa–4–ciano–hidroxicinamico
Ácido sinapínico
indício de glicosilação
Diferenças no padrão de produção da lipase em função da fonte de carbono empregada
60 %
80 %
indícios de agregação
Padronização da precipitação
Escolha da melhor condição de purificação
Purificação parcial
verificação de diferenças no padrão de produção em função da fonte de carbono no meio
116
66,2
45
35
25
18,4
14,4
kDa
~58 kDa
P80
~58 kDa
~45 kDa
k = [C]
l = pH
m = PO
n = [C]*PO
o = [C]*pH*PO
Metodologia
duas lipases?
Rendimento da estratégia
60%
80%
Efeito de cátions
Reagente de cinética
pH 8,0 com pNPP
0,09 mol/L de glicina
0,03 mol/L do cátion
+
Adição da enzima e monitoramento a 410 nm.
Especificidade de substratos
Reagente de cinética
pH 8,0
+
Adição da enzima e monitoramento a 410 nm.
pNPP
pNPM
pNPD
Efeito da temperatura
Reagente de cinética
pH 8,0 com pNPP
Adição da enzima e monitoramento a 410 nm.
60 %
80 %
5, 15, 25, 30, 35, 45, 55 e 60 ºC
15, 25, 35, 45, 50, 55 e 60 ºC
Efeito de cátions na atividade lipásica
Especificidade dos substratos das frações purificadas
60%
80%
diferença entre frações
60%
80%
diferença entre frações para pNPM
Efeito da temperatura na atividade das frações
60%
80%
diferença entre frações
mais de 2 lipases (?)
Cromatografia
Curvas espinodais
Preparação
dos sistemas
Combinação dos fatores
Verificação de formação de fases
Níveis descritos pela literatura
Prediz uma faixa ótima ao invés de um ponto
Faixa mais comum de teste
[N]
densidade celular média
menos significativa para explicar a variação dos dados sobre a média
pH
proteína ativa relativa
maior eficiência de produção por célula
maior pureza do sobrenadante em pH mais elevado
íon
Atividade
significativas
[N]
atividade
densidade celular
atividade normalizada
Efeitos nas médias
3
2
2
resposta pretendida
[N]

Manutenção
Variação de fosfato
Variação de pH
Variação da [C]
Duas fontes de C
NaNO
60%
80%
Gel
Filtração
Troca
Iônica
Fase
Reversa
Nova estratégia
Gel filtração
Troca aniônica
Afinidade
Ultrafiltração 30kDa
30min incubação
Etapa adicional - Fase reversa
Fase B: MeOH

0-10min: 0%B
10-40min: 0-80%B
40-42min: 80-100%B
1.0mL/min
Aquapore RP
depleção atividade
Atividade em um pico com quase toda proteína eluída
60%
80%
GN6
GN8
ON6
ON8
Superose 12
Tris-HCl 25mM
pH 8.0
1mL/min
Diferenças no padrão de produção da lipase em função da fonte de carbono empregada
60 %
80 %
Eficiência da ultrafiltração
Frações retidas

Lipase(s) >30kDa
Eficiência da cromatografia por afinidade
Teste com sobrenadante
Todas possíveis lipases
Maior ativ. pool 10 e 11
Menor ativ. pool 2 e 3
Maior ativ. pool 10 e 11
Maior ativ. pool 2 e 3
Purificação parcial de
M. spathulata
10x
10x
10x
10x
Meio com maior atividade
Óleo de oliva
formação de fases
pH 7,0
pH 8,0
pH 9,0
fase
sem fase
Definir uma formulação matemática capaz de determinar as quantidades de:
pH
fosfato
a fim de garantir a independência das variáveis.
Independência de pH e PO
4
HPO
4
α
pH
H PO
4
2
PO
4
α
HPO
H PO
4
+
2
4
mHPO = [PO ] x V
4
4
pH
c
Espaço de resposta
[C] x PO
4
alto ajuste do modelo
Efeito do pH na atividade das frações
80%
60%
duas regiões ótimas
Efeito do pH
Reagente de cinética
com pNPP com politampão
Adição da enzima e monitoramento a 410 nm.
60 %
80 %
2,3 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0
6,5 7,0 7,5 8,0 9,0 9,5 10,3
3
Produção de emulsificantes
15º dia
nenhuma das variáveis estudadas explicaram a produção de emulsificantes para esse dia



p<0,1
p>0,1
p<0,1
p>0,1
Rastreamento das frações ativas
Padronização da precipitação
Verificação do padrão de produção
X
fonte de carbono
Purificação parcial da lipase de
Moniliella spathulata R25L270
60%
atividade (U.L )
-1
abs 280nm
atividade (U.L )
-1
abs 280nm
atividade (U.L )
-1
abs 280nm
atividade (U.L )
-1
abs 280nm
atividade (U.L )
-1
abs 280nm
SEJA BEM VINDO!
frações
frações
frações
frações
atividade
atividade
atividade
frações
frações
atividade
atividade
atividade
atividade
Agradecimentos
A realização desse trabalho não seria possível sem:
os amigos do LEFQP
à minha família e amigos
que são muitos e
não cabem na foto
mas estão todos em
meu coração
Full transcript