Sequenzierung nach Sanger

Sequenzierung nach Sanger
Was ist Sequenzierung
- Analytisches Verfahren zur Bestimmung der DNA oder
eines ganzen Genoms
Ablauf der Sequenzierung
- DNA wird zu Einzelsträngen denaturiert
- Einzelstränge werden mit Primer, DNA-
Polymerasemolekülen und Desoxyribonukleosid-Triphosphaten versetzt
Desoxyribonukleosid-Triphosphate
- kurz dNTP
- es gibt 4 verschiedene (C,T,G,A)
- für die Synthese des Doppelstrangs
Ablauf der Sequenzierung
- DNA wird zu Einzelsträngen denaturiert
- Einzelstränge werden mit Primer, DNA-
Polymerasemolekülen und dNTP versetzt

- geringe Menge Didesoxyribonukleosid-Triphosphate wird
hinzugegeben
Didesoxyribonukleosid-Triphosphate
- kurz ddNTP
- es gibt 4 verschiedene
- jedes mit unterschiedlichen
Fluoreszensmarken versehen
- am 3'-Kohlenstoffatom der Desoxyribose fehlt die
Hydroxylgruppe -> kann an kein weiteres Nukleotid anknüpfen
Ablauf der Sequenzierung
- DNA wird zu Einzelsträngen denaturiert
- Einzelstränge werden mit Primer, DNA-
Polymerasemolekülen und dNTP versetzt
- geringe Menge ddNTP wird hinzugegeben

- DNA-Polymerase bildet einen komplementären
Strang beginnend am 3'-Ende des Primers
- baut die DNA-Polymerase zufällig ein ddNTP ein, bricht die
Synthese an dieser Stelle ab -
Kettenabbruchmethode
- unterschiedlich lange DNA-Stücke entstehen, die mit einem
fluoreszierenden ddNTP enden

Bestimmung der Nukleotidsequenz
- die neuen Stränge werden, durch Erhitzen, von den
Matrizen getrennt und durch Elektrophorese sortiert
- Fluoreszenzlicht entsteht durch einen Laserstrahl und wird
von einer Fotozelle erfasst
- durch die Wellenlängen wird es den Basen zugeordnet
- durch die individuelle Farbe jedes ddNTP kann bestimmt
werden, welches ddNTP sich am Ende eines Fragments befindet
- diese Abfolge bestimmt die Nukleotidsequenz des
synthetisierten DNA-Strangs und wird in die Sequenz des Matrizenstrangs umgewandelt
Inhalt
- Frederick Sanger
- Was ist DNA-Sequenzierung?
- Ablauf der Sequenzierung
- Desoxyribonukleosid-Triphosphate
- Didesoxyribonukleosid-Triphosphate
- Bestimmen der Nukleotidsequenz
- Shotgun-Methode
- Fortschritte
- Ihr seid gefragt - Lösung des Problems
- Quellen
- Fragen
Frederick Sanger
- * 13. August 1918
- † 19. November 2013
- Biochemiker
- 1958 1. Nobelpreis für Chemie für die Aufklärung der
Struktur des Insulins und seine Arbeiten zur Proteinsequenzierung
- 1980 2. Nobelpreis für Chemie für die Untersuchungen zur
Ermittlung der Basensequenz in Nukleinsäuren zusammen mit Paul Berg und Walter Gilbert

- Methode zur Sequenzierung entstand während er als
Leiter der Abteilung Proteinchemie am Laboratory of Molecular Biology in Cambridge arbeitete
- Methode zuerst für RNA, wurde dann bei DNA
angewandt
Shotgun-Methode
- DNA wird durch Restriktionsenzyme oder Ultraschall in
Fragmente zerlegt
1. Fragmente werden sequenziert
2. Überlappungen werden ermittelt
3. Software bestimmt überlappende Fragmente und setzt
die Gesamtsequenz zusammen
Fortschritte
- Laborroboter und Computer führen die Sequenzierung
durch
- Zeit- und Kostenaufwand sinkt


- "Wie Großwildjäger suchen Forscher
Krankheitsgene" - Die Welt

Quellen
Biotechologie - Werkzeuge der Gentechnik

http://www.mallig.eduvinet.de/bio/gentecnk

http://de.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger

http://server.pg.gd.bw.schule.de/~MuellerN/ABKettenabbruch.htm

http://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html

http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/shotgun.html

http://lerninhalte.blogspot.de/2013/04/dna-sequenzierung-kettenabbruchmethode.html

http://www.apotheken-umschau.de
Fragen?
“Unlike many scientists, I decided to retire and give up research when I reached the age of 65. This surprised my colleagues, and to some extent myself also. I had not thought about retirement until I suddenly realized that in a few years I would be 65 and would be entitled to stop work and do some of the things I had always wanted to do and had never had time for. The possibility seemed surprisingly attractive, especially as our work had reached a climax with the DNA sequencing method and I rather felt that to continue would be something of an anticlimax.” - Frederick Sanger
Ihr seid gefragt - Lösung des Problems