Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ İLE ENZİM ÜRETİMİ

No description
by

samet küçükhaskul

on 12 May 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ İLE ENZİM ÜRETİMİ

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ İLE ENZİM ÜRETİMİ
ENZiM ÜRETiMi
Enzimler mikroorganizmalardan olduğu kadar bitkilerden ve
hayvan dokularından da elde edilmektedirler. Fakat genellikle klasik yöntemlerle elde edilen bu enzimler günümüzde kullanılan modern gıda üretim yöntemlerine uyum
sağlayamamaktadırlar.

Enzimlerin ekspresyonu için temel olarak üç bileşeni gerektirir:
bir gen, geni içeren
vektör ve ekspresyonu gerçeklestirecek konak hücre.
Enzim eldesinde ürünün
miktarı da oldukça önemlidir. Dolayısıyla konak hücrelerin rekombinant enzim
üretiminde önemli rolleri bulunmaktadır.

Rekombinant DNA teknolojilerinin gelişmesi ile gıdalarda rekombinant mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin kullanılması fikri önem kazanmıştır.
Rekombinant mikroorganizmaların kullanılması düşük maliyet ve yüksek erimlilikle enzim eldesini sağlamaktadır.
Fakat elde edilen enzimler gıdalarda kullanılacagı için, konak mikroorganizmaların patojenik ve toksijenik potansiyelleri önemlidir.
Bu sorun da konak organizmaların mutasyonla güvenilir hale getirilmesiyle veya fermantasyon koşulları düzenlenerek toksin üretilmesine engel olunmasıyla aşılmaktadır.

Gıdaların işlenmesinde kullanılan enzimlerin endüstriyel olarak üretimi 1874’lere uzanmaktadır.
Danimarkalı arastırmacı Christian Hansen peynir işlemi için buzağıların karınlarından rennin (kimozin) ekstrakte etmistir. Kimozin günümüzde rekombinant DNA teknikleri ile bovine prokimozin genine sahip
mikroorganizmalarca üretilmektedir.
Bovine kimosin
E. coli
K-12’de ifade edilmistir ve US Food and Drug Administration (FDA) tarafından onaylanan ilk rekombinant enzimdir.


B. subtilis, B. licheniformis, A. niger, A. oryzae gibi birçok bakteriyel ve fungal strain
gıda proseslerinde kullanılan enzimlerin üretimi için konak hücre olarak
kullanılmaktadırlar. Bu organizmalar uzun yıllardır enzim üretiminde kullanılmakta olup,
endüstriyel üretim kosulları altında oldukça iyi üretilebilmektedirler. Bunlar aynı
zamanda genetik manipülasyonlara uygundurlar ve fermantasyon ortamında bol
miktarda enzim üretebilirler.

Konak mikroorganizmalar
Bacillus subtilis
B. subtilis
uzun yıllardır özelikle alfa amilaz ve proteazlar gibi gıda islemlerinde kullanılan enzimlerin üretiminde konak organizma olarak kullanılmaktadır.
B. subtilis
tarafından üretilen rekombinant enzimlerin güvenligi FDA’ya sunulan GRAS (Generally recognized as safe) tebliginde ve çesitli çalısmalarda belirtilmistir.
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens
ve
B.
stearothermophilus
’un (özellikle alfa amilaz enziminin üretiminde) gıda islemlerinde açısından konak hücre olarak kullanılmalarının güvenli oldugu belirtilmistir.

Son on yılda,
B. licheniformis
ve
B. amyloliquefaciens
rekombinant enzimlerin ekspresyonunda kolaylıkla kullanılmıslardır.
İki endüstriyel
B. licheniformis
straininin tüm genomunun sekansı çıkartılmış ve
B. subtilis
’in sekansına büyük oranda benzer oldugu, fakat insanlarda patojen olan
B. cereus
ve
B. anthracis
’ten farklılık gösterdigi belirlenmistir.
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens
ve
B. stearothermophilus
’un güvenilirligi birçok çalışmada belirtilmiştir.

Bacillus türlerinin yabani tip strainleri besin kısıtlanması durumunda sporulasyona girerler.
B. thuringiensis
pestisidal proteinleri gibi bazı önemli ticari bilesikleri sporulasyon esnasında olustururken, gıda proseslerinde kullanılan enzimlerin üretimi
sporulasyon ile engellenirler. Bu sebeple sporulasyon olusturmayan mutantlar gelistirilip rekombinant enzimler için konak hücre olarak kullanılmaktadırlar.
Bacillus türlerinin heterolog enzimlerin ve diger proteinlerin üretiminde kullanılmasının
avantajlarından biri proteinlerin dogrudan fermantasyon ortamına verilmesidir.

E. coli
K12
1990 yılında FDA
E. coli
K-12 tarafından üretilen kimozin enzimini GRAS olarak onaylamıştır.
E. coli
K-12, uzun yıllardır laboratuarda kullanılmaktadır.
Bu mikroorganizma sindirildiginde toksin üretmemektedir.
E. coli
K12 çalısması oldukça maliyetli bir bakteridir. 1997’de genom sekansı belirlenmiştir.
E. coli
K-12 kimyasalların ve insanlarda kullanılan ilaçların üretiminde güvenilir bir şekilde kullanılmaktadır.

Pseudomonas fluorescens
Gram negatif toprak bakterisidir ve insanlarda hastalık yapmamaktadır.
Yabani tip strain MB101, Kaliforniya’da marullardan izole edilmistir ve a-amilaz üretiminde konak organizma olarak kullanılmaktadır.
Bu strain 1989’dan beri tarımsal uygulamalarda kullanılan
B. thuringiensis
insektisidal proteininin üretimi için kullanılmaktadır.

Aspergillus oryzae ve A. niger
Her iki organizma da ekmek üretim, mayalama ve diger gıda uygulamaları için kullanılan enzimlerin kaynağıdır.
Her iki tür de patojenik veya toksijenik degildir.
Bazıstrainleri, mikotoksinler gibi toksik sekonder metobolitleri düsük miktarda da olsa üretmektedirler.
Fermantasyon kosulları degistirilerek bu türlerin mikotoksin üretimi
engellenebilecegi bildirilmistir.

Mikrobiyel enzimler, dogal ya da rekombinant olsalar da kontrol altında tutulan koşullardaki fermantasyon işlemi ile üretilirler. Enzim üretimini en üst seviyeye çıkarmak için, sıcaklık, pH, havalandırma gibi parametreler kontrol altında tutulurken, fermantasyon ortamının içeriğindeki bileşenler de çok iyi seçilmis olmalıdır. Dekstroz, nisasta, yeast ekstrakt, amonyum, üre ve mineraller bir fermantasyon ortamında en sık kullanılan bileşenlerdir. Köpük kırıcı ajanlar, pH düzenleyiciler de bir fermantasyon ortamında bulunurlar. Tüm bu bileşenler enzim üretimini olumlu ya da olumsuz yönde etkilemektedir.
Günümüzde üretilen rekombinant enzimlerin çogu ekstraselülerdir ve fermantasyon ortamına bırakılırlar. Enzim, hücresel kütleden ayrılır, çözdürülür ve konsantre hale getirilir. Son ürün, organizmanın ürettigi metabolitleri veya fermantasyon veya 5 proseste kullanılan bileşenleri de içerebilir. Bu sebeple üretimin ardından enzimlerin içerigi test edilmektedir.
Kimozin
Dünya üzerinde süt endüstrisinde, peynir yapımı için yılda 100 milyon dolar değerinde kimozin kullanılmaktadır. Bu geniş kullanımı nedeniyle büyük ölçekte rekombinant kimozin üretimi yoluna gidilmiş ve inek kimozini E. coli‘de klonlanmıĢtır. Bu rekombinant kimozin Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)‘nin 1990‘da insan tüketimi için onayladığı ilk genetik mühendisliği ürünü olmuştur.
Rekombinant kimozinin avantajları şöyle sıralanabilir:
Artan peynir mayası ihtiyacı buzağı kesmeden karşılanabilir.
Çok daha büyük miktarlarda üretim yapılabilir.
Standart kalite ve maksimum verim sağlanır.
Enzimin saflığı yüksek olduğu ve pepsin içermediği için peynirin olgunlaşma süreci kusursuz gerçekleşebilir.
Kalitesiz şirden kullanımından dolayı kaynaklanan peynir kusurlarına rastlanmaz.
Pichia pastoris
süpernatat kültüründe rekombinant kimozin enzimini üretmişlerdir. Bu mikroorganizmayı seçme nedenleri, mikroorganizmanın kendine yabancı rekombinant proteinlerin üretiminde ve sekresyonunda çok kullanışlı olmasıdır. Buzağı abomasumundan RNA izole etmişler ve daha sonra preprokimozin, prokimozin ve kimozinin DNA sekanslarını izole ederek bunları
Pichia pastoris
‘e ekspresse ettirmişlerdir. Bu çalışma ile aktif rekombinant kimozin enziminin üretimini
Pichia pastoris
‘te ilk kez gerçekleştirmişlerdir.
Fakat bu üretim aşamasında rekombinant
E. coli
ve
Pichia pastoris
suşlarının seçimi için zeosin antibiyotiğinin kullanmaları maliyeti artırmıştır. Ayrıca bu şekilde zeosin antibiyotiğini kullanarak yapılan bu üretim sistemi büyük çapta kültür uygulamalarını (Fermentör ve bioreaktör) ekonomik olmamasından dolayı mümkün kılmamaktadır.
El-Sohaimy ve ark., (2010) buzağı abomasumundan RNA izolasyonu yapmışlar ve bu saflaştırdıkları RNA‘lardan da RT-PCR yöntemiyle kimozinin cDNA‘sını üretmişlerdir. Daha sonra elde ettikleri cDNA‘yı kullanarak
E. coli
‘de rekombinant kimozin üretmeyi başarmışlardır. Araştırıcılar ürettikleri kimozin ile yaygın olarak kullanılan emsallerini karşılaştırdıklarında rekombinant kimozinin diğerlerine göre %105 oranında daha fazla pıhtılaştırıcı aktiviteye sahip olduğunu görmüşlerdir.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜT TEKNOLOJİSİ ANA BİLİM DALI
SAMET KÜÇÜKHASKUL

KAYNAKÇA
Rekombinant DNA. h
ttp://www.mikrobiyoloji.org/TR/Genel/DosyaGoster.aspx?DIL=1&BELGEANAH=2999&DOSYAISIM=01%20Cerci.pdf
Erişim tarihi: 11.05.2015
Ulusu, Y. (2012)
. Endüstriyel Kullanım Amaçlı Kimozin Enziminin Alternatif Bir Sistemle Rekombinant Olarak Üretilmesi, Saflaştırılması ve Karakterizasyonu.
Doktora Tezi, Gaziosman Paşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Ana Bilim Dalı
Full transcript