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Marcadores Moleculares: Nucleares y mitocondriales, y sus ap

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María Rosas

on 20 December 2013

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Marcadores Moleculares: Nucleares y
mitocondriales y sus aplicaciones

Semaforonte: Término acuñado por Hennig que significa "portador del carácter". Hace referencia al objeto de estudio filogenético. Un semaforonte no tiene que ser necesariamente una especie, pudiendo ser uno de los estadios del desarrollo de una especie (la mariposa y su oruga son dos semaforontes distintos). Al conjunto de todos los caracteres de un semaforonte se le llama holomorfo
Una ventaja de los marcadores moleculares para estudiar Ia variación con respecto a las estrategias clásicas, es que las metodologías para obtenerlos se pueden aplicar a cualquier gen o a sus productos génicos y a la genética de cualquier organismo desde mi­crobios hasta ballenas
Un marcador genético o molecular es un segmento de DNA con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear
La existencia de polimorfismo en las poblaciones tiene gran importancia para el estudio de varios procesos biologicos (adaptación,
especiación, conservación, etc.) en Ia ecología evolutiva y sistemática. Por ejemplo, gracias a que existe variación a escala individual, poblacional y específica. es posible encontrar atributos heredables que hacen posible inferir si los semaforontes o variantes bajo examen
pertenecen o no al mismo organismo, a Ia misma po­blación o a Ia misma especie.
La variación en cualquier sistema de características (morfológicas o moleculares) puede reflejar una combinación de los factores ecológicos, genéticos e históricos.
Un tipo de variación es el
polimorfismo
, el cual surge como consecuencia de alteraciones en el DNA, ya sea a nivel de nucleótidos (substitución de una base por otra), al nivel de segmento de DNA (deleción. adición, inversión y transferencia de DNA de una posición a otra) o como consecuencia de la recombinación.
Los marcadores moleculares se detectan a través de una serie de métodos o técnicas que exploran Ia variación de los organismos a nivel de proteínas o DNA globalmente y a nivel de un locus o varios loci en particular.

La variación se puede explorar a través de los siguentes métodos.

1. Las reacciones inmunológicas

2. La electroforesis de izoenzimas

3. La secuencia de proteínas,

4. La hibridación de DNA

5. Los fragmentos de restricción de longitud poli­mórfica (RFLPs)

6. Los mapas génicos

7. El polimorfismo del DNA amplificado al azar (RAPDs)

8. La huella digi­tal del DNA (VNTR" o fingerprinting)

9. Los microsatélites

10. La conformación polimórfica de cadena sencilla (SSCP)

11. La secuencia de DNA entre otros.
1. Las reacciones inmunológicas
2. La electroforesis de izoenzimas
3. La secuencia de proteínas
4. La hibridación de DNA
5. Los fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLPs)
6. Los mapas génicos

7. El polimorfismo del DNA amplificado al azar (RAPDs)
9. Los microsatelites
8. La huella digi­tal del DNA (VNTRs o fingerprinting)
10. La conformación polimórfica de cadena sencilla (SSCP)
11. La secuencia de DNA
Los primeros procedimientos que se emplearon para Ia obtención de marcadores moleculares en proteínas fue­ron las reacciones inmunológicas.

A estos le siguieron Ia secuencia de aminoácidos de las proteínas y Ia elec­troforesis de isoenzimas.

Las reacciones inmunológi­cas consisten en Ia respuesta inmune de los organismos a macromoléculas extrañas conocidas como antígenos.

En este tipo de reacciones se hace uso de proteínas o polisacáridos que son abundantes y fácilmente purifi­cables.

La secuencia de ami­noácidos consiste en la liberación progresiva de los aminoáidos de una proteína y Ia identificación de cada uno de ellos a través de una cromatografía o electroforesis
Las propiedades eléctricas de las proteínas permiten estimar diferen­cias en su movilidad sobre una matriz electroforética.

Cada uno de los 20 aminoácidos tienen una cadena la­teral caracterizada por su forma, tamaño y carga positiva o negativa.

Estas cadenas laterales son las principales responables de la carga total del movimiento de una proteína a través del gel durante una electroforesis.

Este método se realiza con varias proteínas enzimáticas para Ias que existen tinciones histoquímicas especificas
El procedimiento mas común para secuenciar una proteína es el conocido como "Edman", usado en Ia mayorfa de los instrumentos disponibles comercialmente.

Este método requiere de proteínas altamente purificadas, las cuales son sometidas a una reacciónón química para modificar sus aminoácidos.

Los aminoácidos ya modificados se separan progresivamente de la cadena polipeptídica para posteriormente identificarlos a través electroforesis o una cromatografía en fase reversa.

La técnica Edman está limitada a secuenciar sólo pequeñas cadenas polipeptídicas de hasta 40 aminoácidos. Para conocer Ia secuencia completa de una proteína primero se fragmenta química o enzimáticamente.
Fue uno de los primeros marcadores para de­tectar variación en Ias poblaciones.

Estas observaciones se rea­lizan en DNA total nuclear y particularmente Ia fracción de genes de copia única.

Los puentes de hidrógeno que unen los pares de nucleótidos de las cade­nas complementarias se rompen cuando Ia temperatura se aumenta. Esto provoca que el DNA se disocie en cadenas sencillas. Si la temperatura baja, los puentes de hidrógeno se establecen y entonces las cadenas se reasocian nuevamente. Debido a que se encuentra en mayor proporción el DNA repetitivo,éste se reasocia más rápidamente que el DNA de copia única. La fracción de DNA repetitivo se retira y sólo el DNA de copia única se hace hibridar con DNA de Ia misma especie (homoduplex) y con Ia de otras especies (heterodu­plex).

El último paso es caracterizar Ia estabilidad tér­mica del homoduplex y compararla con la de la hetero­duplex. La estabilidad térmica depende de Ia similitud de Ia secuencia de los­ nucleótidos en las dos cadenas. Las diferencias en Ia es­tabilidad se interpretan como una medida de Ia similitud­ o disimilitud genótipica dentro y entre las especies
Los RFLPs son uno de los marcadores que más se utilizan para el muestreo de Ia variación entre los individuos. El polimorfismo se detecta debido a Ia habilidad de las enzimas de restricción para cortar una cadena de DNA en posiciones específicas. lo que genera un número limitado y comparable de fragmentos de longitud variable. Los RFLPs se buscan en el DNA de cloroplastos, de mitocondrias o del núcleo.
A partir de los RFLPs se pueden construir mapas de restricción de los individuo. En Ia elaboración de estos mapas se determina no sólo el número y la longitud de los fragmentos, sino también el orden relativo de los sitios de restricción de la enzima
La técnica de los RAPDs (random amplified polymorphic DNAs). se basa en la amplificación al azar de fragmentos de DNA polimórficos anónimos.

Para ello se usa una reacción de amplificación standar que genera fragmentos de DNA relativamente cortos, de entre 200 a 2000 pares de bases.

Esta amplificación, tiene la particularidad de que solo se usa un iniciador cuya secuencia de nucleótidos es arbitraria. por lo general incluye solo 10 bases.
Los VNTRs (variable number of tandem repeat [número variable de secuencias repetidas en serie]), también cono­cidos como ''DNAs fingerprinting'' o huella digital del DNA.
La huella genética es una técnica que se utiliza para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su DNA
La huella genética se utiliza en la medicina forense para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos, las pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos.
Es un método electroforético que permite la detección indirecta de mutaciones y polimorfismos. El principio de este método se basa en que la movilidad electroforética de una molécula en un gel es sensible al tamaño, carga y forma de la molécula.

En el análisis de la SSCP, una secuencia mutada es detectada como un cambio de la movilidad en el gel causado por su estructura o conformación alterada.

La SSCP detecta del 70% al 95% de mutaciones en los productos de PCR de 200 pb y de menor tamaño.
Los microsatélites (SSR o STR por sus acrónimos en inglés, son secuencias de DNA en las que un fragmento (cuyo tamaño va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos
Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del DNA. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. Sin embargo, la variabilidad que presentan resulta útil para su uso como marcadores moleculares, es respecto al número de repeticiones, no de la secuencia repetida. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la genética como parentescos y estudios poblacionales.
Para explorar Ia variación a nivel de secuencias del DNA nuclear o extranuclear. primero se selecciona un segmento particular del genoma (gen, intrón, secuencia espaciadora. etc.), cuya tasa de mutación sea apropiada para estudios a escala individual. poblacional o específica. A nivel de especies o categorias superiores las secuencias de DNA son ampliamente usadas en sistemática. Eso se debe a que se han detectado diferentes sectores del genoma que contienen variación taxonómicamente útil.
Gracias
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