Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

REKOMBİNANT KOLONİ SEÇME TEKNİKLERİ

No description
by

Candan Akdır

on 6 January 2016

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of REKOMBİNANT KOLONİ SEÇME TEKNİKLERİ

YÜKSEK LİSANS ÖĞRENCİSİ
CANDAN AKDIR

REKOMBİNANT KOLONİ SEÇME TEKNİKLERİ
Rekombinant seçimi
, rekombinant DNA teknolojisinde meydana getirilen rekombinant denilen yeni gen yapılarını taşıyan klonlardan istenilen özellikleri taşıyanları diğerlerinden ayıklama işlemine denir.

rDNA molekülleri sokuldukları konak hücrelerinde ikileşme yaparlar ve bu şekilde taşıdıkları gen parçalarının çok sayıda kopyasını oluşturabilirler.

Konak hücre içerisinde istenilen geni almış olan rekombinant hücrelerin seçilebilmesi gen klonlamasında en önemli aşamalardan birini oluşturmaktadır.

Çünkü, rekombinant DNA oluşturulması ve transformasyon sırasında başarı olasılığı genellikle çok yüksek değildir.
Nükleik asit melezleme yöntemleri, rekombinant DNA teknolojisinde konak hücrelerden rDNA'yı alanların doğrudan bu DNA varlığının saptanmasıyla seçilmesi yöntemleridir. Bu yöntemin moleküler düzeydeki özelliği; tamamlayıcı özellikte olan nükleik asit molekülü zincirleri arasında melez moleküller oluşabilmesidir. Bu amaçla sonda (prob) denilen polinükleotidlerden yararlanılır. Sondalar izlenen genin bir kısmı ya da tamamını içermektedirler.

-Nükleik asit melezlemesinde ki belli yöntemler şu şekilde sıralanabilir:

Koloni melezlemesi,
Plak melezlemesi,
Tek koloni lizat yöntemi.



# Nükleik asit melezleme yöntemleri
Genetik seçim yöntemleri, rekombinant DNA teknolojisinde konak hücreye girmiş rDNA molekülünde bulunan gen veya genlerin belirledikleri özelliklerin (genotipin) bireyde (fenotipte) gözlemlenmesine dayanan seçim yöntemleridir. Bu nedenle bunlara fenotipik yöntemler de denilir.

Genetik seçim yöntemleri mikrobiyolojik tekniklerle birlikte kullanılırlar ve geniş bir populasyonda kolayca kullanılabildiklerinden dolayı oldukça elverişlidirler. Ancak bu yöntemin önkoşulu, izlenen genin içine girmiş olduğu konakta anlatım yapıyor olmasıdır.

Genetik seçimde uygulanan iki teknik şöyledir:

Konak hücrelerde taşıyıcının varlığının seçimi
Taşıyıcıya sokulmuş DNA parçasındaki genin seçimi
# Genetik seçim yöntemleri
İmmünokimyasal seçim yöntemleri, rekombinant DNA teknolojisinde konak hücreye girmiş ve orada anlatım yapabilen yabancı genin immünokimyasal olarak seçilmesini sağlayan yöntemleri kapsar.

Bu yöntemlerin avantajı konakta seçilebilecek bir fenotipik özelliğe yol açmayan genlerinde seçilimine olanak vermesidir. Bu yöntemin uygulanabilmesi için genin anlatım yapması ve bir protein ürünü meydana getirmesi gerekmektedir. Sentez edilen protein konak hücrede daha önce bulunmadığı için antijen olarak kabul edilir bu yüzden bu yöntemde özel antikorlara ihtiyaç duyulmaktadır. Antijen-antikor bağlanması otoradyografiyle tespit edilir.
# İmmünokimyasal seçim yöntemleri
Genetik seçim yöntemleri

İmmünokimyasal seçim yöntemleri

Nükleik asit melezleme yöntemleri
GENEL OLARAK SEÇİLİM İÇİN GEREKLİ YÖNTEMLER 3 ANA BAŞLIK ALTINDA TOPLANIR.
-Otoradyografi-
Radyasyonun fotoğrafik emülsiyonlar üzerindeki etkisiyle dokularda radyoaktif maddelerin yerinin belirlenmesi veya radyoaktif maddelerin yaydığı ışınlarla radyoaktiviteye duyarlı materyallerin üzerinde görüntü oluşturma yöntemidir.

Önceleri radyoaktif birleşiklerle işleme tabi tutulan doku kesitleri, ışığa duyarlı emülsiyonlarla kaplanarak buzdolabında ışık geçirmeyen kapalı bir kutuya yerleştirilir ve değişik zamanlarda pozlanmasıyla radyoaktif maddenin yeri belirlenir.
-Nükleik asit melezlemesinin sağladığı yararlarda şu şekilde sıralanabilir:

Genel olarak bütün klonlama şekillerine uygulanabilir.
İzlenen genin anlatım yapması gerekmez.
Yöntemde, herhangi bir yolla işaretlenmiş uygun bir tamamlayıcı dizisi bulunan herhangi bir DNA parçası kullanılabilir.

ÖĞRETİM ÜYESİ
PROF.DR.FERAY KÖÇKAR

MAVİ BEYAZ KOLONİ SEÇME (XGAL TESTİ)
Transformasyon rekombinant DNA teknikleri kullanılarak hücre dışı uygulamalar ile farklı bir genotipten hücre genotipine doğrudan bir modifikasyon işlemidir.

Transformasyon terimi genel olarak ekzogenik DNA’nın hücre içine alınıp hücre genetiği ile bütünleşmesi anlamına gelir.

Transformasyon işlemine başlamadan önce ilgilenilen gen bölgesi plazmid vektör ile ligaz enzimi aracılığıyla birleştirilir.
Bu işleme ligasyon adı verilir . Genellikle nükleik asitler, örneğin plazmidler kendiliğinden bakteri hücrelerinin içine giremezler bunun için uyarıcı bir etki gereklidir.

Bu yüzden transforme olacak hücre membranlarının daha önceden düzenlenmesi gereklidir.

Kompetan hücre olarak da ifade edilen transforme olacak hücreler kalsiyum klorür ile uyarılır ve hücre membranları ilgilenilen geni içeren plazmid vektörü hücre içine alabilecek şekilde düzenlenir.
1-Hazırlanan kompetan hücreler genellikle -80 oC’de ya da sıvı azotta saklanır. Düşük sıcaklıkta bekleyen kompetan hücreler buz üzerinde 15 dakika boyunca eritilir.

2- 10 µl transforme edilen plazmid (yaklaşık 1-10 ng DNA içermelidir) kompetan hücre ( 100- 200 µl ) üzerine eklenir ve hafifçe karıştırılır.

3-30 dakika buz üzerinde inkübasyon yapılır. Bu aşamada transforme olan plazmid DNA’sının hücreye yapışması sağlanır.
4- Buz üzerinde inkübasyonu yapılan kompetan hücreler 42OC’de bir ya da iki dakika bekletilir. Bu aşamada tüp karıştırılmamalıdır. Isı şoku olarak ifade edilen hücrelerin yüksek sıcaklıkta bekletilmesi hücre membranlarındaki fosfolipidlerin hareketlerini sağlar.

5-Hücreler buz üzerinde beş dakika bekletilir.

6-Hücrelerin buz üzerinde 5 dakika inkübasyonundan sonra herhangi bir antibiyotik içermeyen besiyeri (1 ml) hücrelere eklenir.


7- Hücreler ve besiyeri karıştırılır. Hücreleri ısı şokundan etkilenmeden toplamak için antibiyotik içermeyen besiyeri kullanılır. Hücreler besiyeri ile karıştırıldığında stres durumu ortadan kalkar. Daha sonra hücreler içlerine aldıkları ilgilenilen geni içeren plazmidleri sentezlemeye başlar. Sentezlenen plazmidler bölünen hücrelere aktarılır.

8-Besiyerindeki hücreler 37°C’de inkübe edilir. İlk 15 dakika hücreler karıştırılmaz.

9- Daha sonra 45 dakika 600 rpm’de inkübasyon yapılır.

Hücrelerin antibiyotik içermeyen besiyeri ile bir saat inkübasyonundan sonra, hücreler antibiyotik direncine hazırdır.
10- Kimyasal olarak uyarılan kompetan hücrelerin transformasyon oranı genellikle düşüktür. Bu oran genellikle 1/10.000’in üzerinde değildir. Bu yüzden plazmid içeren bakteriyel hücrelerin seçilimine ihtiyaç duyulur .
Ilgilenilen geni içeren (transforme olan) plazmid DNA içeren hücrelerin seçimi antibiyotik direncine göre yapılır.
Birçok E. coli soyu antibiyotiklere hassastır. Manipülasyon ya da klonlama için kullanılan plazmid DNA’lara antibiyotik direnç geni gen mühendisliği kullanılarak eklenmiştir.
Plazmid DNA’lar içerdikleri antibiyotik direnç özelliğinden dolayı antibiyotik içeren besi ortamında antibiyotiğe direnç gösterdikleri için içinde bulundukları kompetan bakteri hücresi hayatta kalacaktır.
Fakat plazmidi almayan kompetan hücreler antibiyotik direnci kazanamadıkları için öleceklerdir.
Rekombinant plazmidleri (ilgilenilen gen bölgesi ligasyon olan) ve rekombinant olmayan plazmidlerden (ilgilenilen gen bölgesini içermeyen) belirlemek için plazmid vektörün çoklu klonlama bölgesine (MCS) ‘’β-galactosidase’’ geni eklenmiştir.

LacZ geni olarak da bilinen β-galactosidase geni laktozun parçalanmasını katalizler.

Eğer ilgilenilen gen plazmidin çoklu klonlama bölgesine bağlanmışsa bu durumda LacZ geninin bütünlüğü bozulacağı için besiyerinde bulunan laktoz parçalanmayacaktır.
Transforme hücrelerin seçiminde antibiyotik kullanımının yanında iki kimyasala daha ihtiyaç duyulmaktadır.

- IPTG (isopropylthiogalactoside)
-X-gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside).

IPTG β-galactosidase geni için bir uyarıcıdır. Bunun anlamı eğer ortamda IPTG varsa enzim sentezlenir. X-gal ise renksiz, kromojen bir maddedir ve laktoz analoğu olarak kullanılır.

Bu madde β-galactosidase geni sentezlendiği zaman oluşan enzim ile parçalanır ve mavi renk oluşur.

Transforme olmayan hücreler antibiyotik direnci içermediklerinden dolayı antibiyotikli besiyerinde hayatta kalamazlar.
Plazmid çeren fakat ilgilenilen geni içermeyen plazmidi bulunduran hücreler antibiyotik direncine sahiptir.

Bu yüzden antibiyotikli besiyerinde hayatta kalırlar. Fakat çoklu klonlama bölgelerindeki LacZ geninin bütünlüğü bozulmadığı için ortamda bulunan X-gal maddesini parçalar ve mavi renk açığa çıkar.

Fakat ilgilenilen geni içeren Plazmid DNA’daki LacZ gen bütünlüğü bozulduğu için X-gal maddesini parçalayacak enzim sentezlenmez ve böylelikle hücreler mavi renk oluşturmaz, beyaz renkli kalırlar.
Antibiyotik ve mavi-beyaz koloni seçimi için IPTG ve X-gal içeren katı besiyerine hücrelerin aktarılması;

a. Steril spatula %70 etanol ile temizlendikten sonra ateşe tutularak alkolün yanması sağlanır.

b. Daha sonra spatulanın soğuması beklenir.

c. 100 µl hücre süspansiyonu nütrient agar üzerine yavaşça aktarılır.

d. Bakterileri agarın yüzeyine yaymak için soğumuş spatula kullanılır.

e. Hücrelerin aktarıldığı plate katı besiyeri içeren taraftan etiketlenir.


Hücreleri içren plate’ler oda sıcaklığında bekletilerek hücre süspansiyonunun tamamını alması sağlanır.

Daha sonra plate’ler ters çevrilerek 37 °C’de inkübe edilir. Transforme olan hücreler 12-18 saat sonra gözükür.

Inkübasyon sonrası plate içinde hayatta kalan bakteriler besiyerinde bulunan antibiyotiğe direnç gösteren bakterilerdir. Bu bakterilerde antibiyotik direnci olduğu için plazmid içermesi gerekmektedir.
Bu içerdikleri plazmidlerin transforme olduğunu anlamak için mavi-beyaz hücre seçimi yapılmalıdır.

Plate üzerinde bulunan mavi kolonilerde X-gal parçalandığı için enzim sentezlenmesi gerekmektedir.

Enzim sentezlenen plazmidin LacZ gen bütünlüğü bozulmadığı için istenilen geni alması mümkün olmaz.

Oluşan beyaz kolonilerde ise X-gal parçalanmadığı 1. için renk değişimi olmamıştır.

Bunun nedeni X-gal kimyasalını parçalayacak olan enzimin sentezlenmemesidir.
Bu enzimin sentezlenmemesi için LacZ gen bütünlüğünü bozacak ilgilenilen genin plazmide ligasyon olması gereklidir.

Böylelikle çoklu klonlama bölgesinde bulunan LacZ geninin bütünlüğü bozulacak ve galaktozidaz enzimi sentezlenmediği için X-gal parçalanmayacak bunun sonucunda da hücre kolonilerinde renk değişimi gözlenmeyecektir.
https://www.google.com.tr/imgres?imgurl=http://nptel.ac.in/courses/102103013/module1/lec2/images/7.png&imgrefurl=http://www.mywallpaper.top/blue-white-colony-screening.html&h=288&w=444&tbnid=Tgzqo29vyTAD8M:&docid=RBQHRVpJxOLc-M&ei=yvCKVtHTNIX8ywOKw7yQDg&tbm=isch&ved=0ahUKEwjR4M2FmZHKAhUF_nIKHYohD-IQMwhkKEIwQg
https://www.google.com.tr/imgres?imgurl=https://i.ytimg.com/vi/MgbEPdwA6UU/hqdefault.jpg&imgrefurl=https://www.youtube.com/watch?v%3DMgbEPdwA6UU&h=360&w=480&tbnid=1XASFMQgVB5WWM:&docid=oqsDU1-UL7DQ3M&ei=yvCKVtHTNIX8ywOKw7yQDg&tbm=isch&ved=0ahUKEwjR4M2FmZHKAhUF_nIKHYohD-IQMwgdKAMwAw
https://www.google.com.tr/search?q=mavi+beyaz+koloni+ayr%C4%B1m%C4%B1&lr=lang_tr&espv=2&biw=1366&bih=643&tbs=lr:lang_1tr&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwj75eWrj5HKAhUGJHIKHbf7BtI4ChD8BQgGKAE#lr=lang_tr&tbs=lr:lang_1tr&tbm=isch&q=blue+white+colony+selection&imgdii=s6QU_i2SI7GoeM%3A%3Bs6QU_i2SI7GoeM%3A%3BtSTe095dn_QrXM%3A&imgrc=s6QU_i2SI7GoeM%3A
KOLONI PCR
Koloni PCR plazmid yapılarında insert DNA'nın varlığını veya yokluğunu belirlemek için uygun yüksek verimli bir yöntemdir.

Bireysel transformantlar ya kısa ısıtma aşamasında su ile liziz edilebilir ya da başlangıç ısıtma adımında PCR reaksiyonuna direkt olarak liziz yapılabilir.

İlk ısıtma aşaması hücrede plazmit DNA'nın serbest kalmasını sağlar ve amplifikasyon reaksiyonu için kalıp olarak kullanılır.

Özellikle insert DNA'yı hedef alacak şekilde tasarlanan primerler DNA parçasının varlığını belirlemek için kullanır.

Ek olarak insert komşu DNA vektörlerini hedefleme primerleri, doğru molekül boyutta olup olmadığnı belirlemek içinde kullanılır.

Vektör spesifik primerler kullanılması aynı anda birden fazla yapının taranmasına imkan sağlarken insert spesifik primerler insert DNA'nın spesifikliği ve boyutu hakkında bilgi verir.

Koloni PCR, aynı zamanda insert oryantasyonunu belirlemek için kullanılabilir.

Bir vektör spesifik primer ile eşleştirilmiş, bir insert spesifik primerin kullanıldığı PCR amplifikasyonunda, plazmid insert doğru oryantasyonda olduğu takdirde belirli bir büyüklükte bir amplikon elde etmek için tasarlanabilir.

Ürünün boyutu ve varlığı yada yokluğununu belirlemek için agaroz jel elektroforezi üzerinde DNA marker ile birlikte tesbit edilir.
http://www.csun.edu/~mls42367/Protocols/Colony%20PCR.pdf
https://www.google.com.tr/imgres?imgurl=http://img.pcdn.vresp.com/media/d/6/2/d6252e7e66/356311481e/1e10fc49db/library/Kapa%252520Colony%252520PCR%252520Workflow.jpg&imgrefurl=http://shopping.netsuite.com/s.nl/c.692026/it.I/id.14/.f&h=136&w=637&tbnid=2E-J_tZVuzo93M:&docid=Y79f85UsOq2SzM&ei=dAGMVoyVEMLosQGDu6to&tbm=isch&ved=0ahUKEwiMn8GJnZPKAhVCdCwKHYPdCg0QMwhFKCAwIA
https://www.google.com.tr/search?q=COLONY+PCR&espv=2&biw=1366&bih=643&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwiwhePWlpPKAhUDDywKHWQ8ABUQsAQIMA#imgdii=7ZFPzETWFYjyAM%3A%3B7ZFPzETWFYjyAM%3A%3BhSTu1rWwYlG9EM%3A&imgrc=7ZFPzETWFYjyAM%3A
Plazmid izolasyonundan sonra bütün ürün sekans analiziyle o genin var olup olmadığı belirlenir.
SEKANSLAMA İLE BELİRLEME
Pozitif seleksiyon vektörleri içinde klonlamanın olup olmadığını kontrol etmek için bir reporter gen bulunur.

Reporter genin özelliğine göre klonlamanın olup oladığı kontrol edilir.

Örneğin reporter gen olarak ampisilin geni kullanıldıysa koloniler ampisinli ortamda büyütüldüğünde sadece istenilen vektörün bulunduğu koloniler gelişir.

Repoter gen olarak GSP (green fluorescence protein) kullanılırsa istenilen vektörün transforme olduğu koloniler floresan mikroskobunda görüntülendiğinde GSP den dolayı ışıma görünür. Işımanın olduğu hücrelerde vektör var demektir.

Plazmid izolasyonu yapılan plazmidler restiriksiyon enzimiyle kesilir agaroz jelde görüntü alındığında istenilen gen parçası ve vektörün uzunluğu kadar bant tesbit edilirse klonlama gerçekleşmiş demektir.
RESTİRİKSİYON KESİMİ İLE BELİRLEME
POZİTİF SELEKSİYON VEKTÖRLERİ İLE BELİRLEME
https://www.google.com.tr/imgres?imgurl=https://www.promega.com/~/media/images/resources/figures/11700-11799/11761ta_466px.jpg%253Fla%253Den&imgrefurl=https://www.promega.com/resources/pubhub/using-gotaq-long-pcr-master-mix-for-t-vector-cloning/&h=276&w=466&tbnid=M2Uf7E5XDaxucM:&docid=5r4DeLbWXmAMcM&ei=lRyMVr6sMsmlsgHK3JDoDw&tbm=isch&ved=0ahUKEwj-yrT5tpPKAhXJkiwKHUouBP0QMwgrKBAwEA
https://www.google.com.tr/search?tbm=isch&tbs=rimg%3ACUYcE0o0bHEpIjiVsHaGDtpYMfs57wWIFngJE4238_1Uo5uTUZNJSSeTdcQSjoOUU1wc7VQLDsEZcrSeWd-Ta-r17jioSCZWwdoYO2lgxEcBdsSym2CYxKhIJ-znvBYgWeAkRU_1Stoqe8a-EqEgkTjbfz9Sjm5BHw_1lRf8_1PK4ioSCdRk0lJJ5N1xEbRGOSNbux_1UKhIJBKOg5RTXBzsRmMsz6tTLOmcqEglVAsOwRlytJxHMxMCvDVTl_1yoSCZZ35Nr6vXuOEWDrYxEQ26nq&q=pgem%20t%20easy%20vector&ved=0ahUKEwjC477utpPKAhXM7hoKHZcICXkQ9C8ICQ&biw=1366&bih=643&dpr=1#imgdii=B9ovYt5vqsVdEM%3A%3BB9ovYt5vqsVdEM%3A%3BmSoDaaYVPGwBOM%3A&imgrc=B9ovYt5vqsVdEM%3A
https://www.google.com.tr/search?q=colony+sequencing&sa=N&espv=2&biw=1366&bih=643&tbm=isch&tbo=u&source=univ&ved=0ahUKEwjQluPKopPKAhUH3SwKHUNBAgI4ChCwBAgY#imgrc=ldOyUxRIN4IFSM%3A
https://www.google.com.tr/imgres?imgurl=http://www.genomics.com.tw/imageFiles/site_sequencing_clip_image005.jpg&imgrefurl=http://www.genomics.com.tw/site_sequencing.php&h=209&w=816&tbnid=1qTBYfvwyZckoM:&docid=HVIDy4e5Q2HbQM&ei=ch6MVpG1BsKssAH6vq2YAQ&tbm=isch&ved=0ahUKEwiRtsLcuJPKAhVCFiwKHXpfCxMQMwhuKEkwSQ
Şekil1
https://www.google.com.tr/search?q=dNa&espv=2&biw=1366&bih=643&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiWq_v7v5PKAhVK3SwKHeS3DgcQ_AUIBigB#tbm=isch&q=ger%C3%A7ek+dna&imgrc=nJe4TPCoUD2FTM%3A
Şekil2
http://www.webgentech.org/tr/wgte/dokuman/transformasyon.pdf
Şekil3
http://www.webgentech.org/tr/wgte/dokuman/transformasyon.pdf
Şekil4
Şekil5
Şekil6
Şekil7
Şekil8
Şekil9
Şekil10
Şekil11
Şekil12
Şekil13
Full transcript