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PGPB

Trabajo final Biomol
by

Carla Salvadores

on 25 March 2013

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Transcript of PGPB

INTRODUCCIÓN CONCLUSIONES HIPÓTESIS RESULTADOS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
FACULTAD DE QUÍMICA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA




TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA MOLECULAR





Autora: Salvadores Carla Janet.
Dirigida por: Dra. Cohen Ana Carmen.

Lugar: Laboratorio de Bioquímica Vegetal, Instituto de Biología Agrícola Mendoza-FCA,UNCuyo.

Año: 2012
  Bacterias Promotoras del Crecimiento de Plantas
(PGPB)

Colonizan suelo, agua, hojas y raíces de las plantas.

Cumplen una importante función en el mantenimiento de la biósfera.




Mejoran la productividad de diversos cultivos.

Reducen el uso de agroquímicos (fertilizantes y biocídas).

Mejoran la estructura del suelo (Biorremediación).

Disminuyen costos y contaminación ambiental. Fijación Biológica de N2 Producción de sideróforos Incremento del crecimiento Control de Patógenos Producción de Hormonas
Pseudomonas stutzeri A1501 Pseudomonas fluorescens

Bacillus licheniformis Ácido abscísico (ABA)
Su rol principal es en la respuesta frente al estrés debido a factores bióticos y abióticos.


Lo sintetizan todos los organismos fotosintéticos, plantas y algas, pero también lo producen hongos y algunas bacterias.


Se determinó por primera vez por GC-MS que las cepas A. brasilense Sp 245, P. fluorescens y B. licheniformis producen ABA en medio de cultivo químicamente definido. Pseudomonas stutzeri A1501 Pseudomonas fluorescens Bacillus
licheniformis Azospirillum
brasilense Sp 245

La vía de síntesis y metabolismo del ABA en P. fluorescens se asemeja a la biosíntesis de plantas involucrando derivados carotenoides y al gen crtI, que codifica para la fitoeno desaturasa. ? Biosíntesis de ABA Bacterias: Lo producen plantas, bacterias y otros organismos. Los animales no los pueden sintetizar “de novo” y por ello, necesitan ingerirlos.

Algunos reguladores del crecimiento vegetal como citocininas, brasinoesteroles, ABA, GAs y estrigolactonas son de naturaleza isoprenoide.

Debido a sus propiedades antioxidantes, sus usos como colorantes y sus beneficios para la salud son de gran interés, tanto industrial como nutricional.

Por la fuerte demanda se manipulan genéticamente microorganismos y plantas para enriquecerlos en la producción de carotenoides. Carotenoides Biosíntesis de carotenoides en plantas y vía propuesta en bacterias Loper y col. 2012, PLOS genet Crecimiento celular
Organismos empleados:

(1) P. fluorescens: aislada de la rizósfera de plantas de vid (Cohen et al. 2008).

(2) P. stutzeri A1501: cedida por el Dr. Nicolás Ayub, INTA Castelar. Tg=1,02 Tg: 1,09 P. fluorescens Método de UFC. Método turbidimétrico. P. stutzeri A1501. Curvas de crecimiento celular Plantas: vía indirecta. Hongos: vía directa. Codifica a la enzima fitoeno desaturasa que cataliza la conversión de fitoeno en licopeno por la desaturación en cuatro sitios.

Para poder estudiarlo se recurrió al gen crtI de P. stutzeri A1501 (longitud de 1.518 nucleótidos).

La homología entre el genoma de P. stutzeri A1501 y el resto de los genomas de P. fluorescens determinó que sólo compartían un 27-30 % de sus genes. Gen crtI Objetivo 1

Evaluar la presencia del gen crtI que codifica para la enzima fitoeno desaturasa en P. fluorescens. Extracción de ADN genómico Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de extracciones de ADN de P. fluorescens a diferentes tiempos. Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa de extracciones de ADN de P. stutzeri A1501 a diferentes tiempos. Características generales de los cebadores empleados. Concentración de ADN (concentrado y diluido 1/10 y 1/100 ).

Concentración de dNTPs (0,2 mM, 0,5 mM y 10 mM ).

Concentración de los cebadores (1 µM, 2 µM, 4 µM y 10 µM ).

Concentración de Mg2+ (1 mM, 1,5 mM, 2 mM y 3,75 mM ).

Temperatura de hibridación (45 ºC a 62 ºC ).

Polimerasas de distintos proveedores (Pfu ADN polimerasa, PB-L Productos Bio-lógicos; Go Taq, Promega; Taq polimerasa, Genbiotech; Taq polimerasa recombinante, Invitrogen y Taq Platinum, Invitrogen). Puesta a punto de la PCR Figura 4: Gel de agarosa con las reacciones de PCR para el fragmento de 988 pb del gen crtI. Ta=60 ºC Figura 3: Gel de agarosa con las reacciones de PCR para el fragmento de 537 pb del gen crtI. Ta= 60 ºC PCR Se secuenciaron en el Instituto de Biotecnología, Unidad Genómica, INTA Castelar. Minipreparaciones de las colonias con los fragmentos de interés Análisis de secuencia Fragmento de 988 pb de P. stutzeri A1501 Objetivo 2

Determinar la producción de carotenoides por P. fluorescens, P. stutzeri A1501, A. brasilense Sp 245 y B. licheniformis en medio de cultivos con y sin la adición del inhibidor DPA. Organismos empleados:

(1) P. fluorescens.

(2) P. stutzeri A1501.

(3) A. brasilense Sp 24: cedida por el Dr. Raúl Pedraza, UNT, Tucumán.

(4) B. licheniformis: aislada de la rizósfera de plantas de vid (Cohen et al. 2008). Extracción e identificación de carotenoides Extracción de carotenoides Medir el sobrenadante a 200-800 nm Sonicar Dejar toda la noche a 4 ºC (1) Metanol.
(2) Acetona.
(3) Acetona-metanol (7:3).
(4) Dimetilsulfóxido (DMSO). Adicionar solvente Cultivo + DPA Cultivo control Intermediarios carotenoides
involucrados en la biosíntesis de ABA. Figura 6: Espectros de absorción UV a partir de extracciones de pigmentos de B. licheniformis empleando acetona-metanol (7:3).
A: Cultivo control de 4 d. B: Cultivo de 4 d con DPA. C: Cultivo control de 7 d. D: Cultivo de 7 d con DPA. D B Figura 5: Espectros de absorción UV a partir de extracciones de pigmentos de cultivos de P. fluorescens de 4 d.
Parte superior: Acetona. A: Control, B: DPA.
Parte inferior: DMSO. C: Control, D: DPA. La velocidad de crecimiento fue mayor para P. fluorescens, lo que indicó que su tiempo de duplicación fue menor.

Se encontró que el tiempo adecuado para la extracción de ADN de calidad fue de 9 h para P. fluorescens y de 15 h para P. stutzeri A1501.

Se amplificó y purificó los fragmentos de 537 y 998 pb correspondientes al gen crtI de P. stutzeri A1501. Esto confirmó que la metodología utilizada fue adecuada.

Se intentó la amplificación del gen crtI en P. fluorescens, lo que permitió establecer que el mismo no tiene homología a nivel nucleótidos con el presente en P. stutzeri A1501.

Se propone que la cepa P. fluorescens en estudio podría ser P. fluorescens A506, secuenciada recientemente. En ésta, aún no se ha identificado a la enzima codificada por el gen crtI pero si a otros miembros de la vía como a la ß-caroteno hidroxilasa, codificada por el gen crtZ. La mezcla acetona-metanol (7:3) permitió detectar picos definidos que corresponden a diferentes carotenos. El perfil de pigmentos extraídos por esta mezcla fue similar a la que se obtuvo con acetona.

El DMSO fue el único solvente que permitió visualizar un valor de absorbancia característico de fitoeno.

Se observó que P. fluorescens produciría fitoflueno, carotenoides (ç-caroteno, ß-caroteno o zeacaroteno) y xantinas (auroxantina y mutatoxantina). Esto será confirmado por cromatografía.

La DPA inhibió la producción de diferentes carotenoides lo que corroboró la existencia de una enzima del tipo fitoeno desaturasa. GRACIAS
por su atención!!! AGRADECIMIENTOS Cohen y col. (2008) Plant Growth Regul.
Salomón y col. (2010) XXVIII RAFV.
“ESTUDIO DEL GEN CRTI, DE LA PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS EN PSEUDOMONAS FLUORESCENS Y SU RELACIÓN CON EL ÁCIDO ABSCÍSICO” Por qué estudiar PGPB? Clonación Transformación de células TOP10 competentes con los productos de ligación.

Selección blanco-azul.

Identificación de los productos clonados por PCR. Tabla 2: Especificación de los componentes, su concentración y volúmenes utilizados en la preparación de las PCR. Identificación de los productos clonados A C Tabla 1: Especificación de los programas de PCR empleados para la amplificación de fragmentos del gen crtI.

A: 988 pb, B: 537 pb. Condiciones finales Geles de agarosa con PCR empleando como templado colonias transformadas. Fragmento de 988 pb de P. fluorescens Análisis de secuencia Fragmento de 537 pb de P. stutzeri A1501 Fragmento de 537 pb de P. fluorescens a B C D Azospirillum brasilense Sp 245 m BLASTx: 100% de identidad con la fitoeno desaturasa de P. stutzeri A1501. BLASTx: 99% de identidad con una proteína hipotética de P. fluorescens A506. BLASTx: 100% de identidad con la fitoeno desaturasa de P. stutzeri A1501. BLASTx: 98% de identidad con una proteina de fusión de membrana de P. fluorescens A506. Conclusión final Si bien en P. fluorescens no se logró identificar al gen crtI que codifica para la fitoeno desaturasa, los resultados obtenidos en pigmentos al usar DPA nos permitieron corroborar la existencia de una enzima de tipo desaturasa similar a la presente en plantas. En primer lugar le quiero agradecer a Dios y a la Virgen Maria por guiarme y cuidarme en todo momento.

A uno de mis angelitos protectores, mi papá Carlitos. Por su legado, su fuerza, compañía y presencia.

A mis personas favoritas en el mundo, mis nonos Olga y Santiago (mi otro angelito), por darme amor y cuidados únicos. Por haberme formado y ser mucho más que un ejemplo. Porque son y serán parte de mí...

A Lucia, mi madre y amiga del alma, por su fortaleza y lucha constante. Por enseñarme a creer y soñar. Por hacerme sentir que soy capaz y por su amor incondicional.

A mi familia por creer en mí, por apoyarme y darme tanto amor! Luchi, Mari y Pache, muchas gracias por sus cuidados y por siempre estar. A mis hermanos Maxi y Agustín, y a mis primos que son como mis hermanos: Piti y Facu. Y como no dedicarle esta tesis a la nueva integrante de la familia! Bienvenida Francesca!

A Elvis, mi amor, por su compañía, ayuda y tolerancia. Por sus cuidados, mimos y por cumplir mis caprichos. Sos la persona que me complementa y en la que puedo confiar y contar siempre.

A Oscar por su ayuda y por estar, principalmente en momentos difíciles. Hay dos personas que merecen ser destacadas ya que marcaron mi inicio y crecimiento en la investigación, brindándome sus apoyos fundamentales…

…A mi querida directora de tesis Ana, que desde el comienzo tuviste una gran voluntad para enseñarme, con paciencia, disposición y compromiso. Estuviste siempre presente, con palabras de aliento y dándome tranquilidad. ¡Gracias por brindarme tu apoyo, por permitirme crecer, por tu amistad y por darme la oportunidad de conocer a tu hermosa familia!

…A la Dr. Sandra Lampasona, por ser mi guía científica, por el conocimiento que nos brindaste y por tu importantísima participación. ¡Gracias por tanto apoyo y por tu asesoramiento!

¡Tengo con ambas una deuda de generosidad difícil de saldar! A la familia Molina por estos años compartidos, fue hermoso conocerlos y sentirme en casa con ustedes. Espero que Dios les devuelva toda la ayuda y generosidad que han tenido hacia mí. ¡Los quiero mucho!

A la abuela Rosa, a mis suegros Mabel y Derli por sus consejos, preocupación y buenos deseos.

A mis compañeros de la facu por tantos momentos únicos e irrepetibles. Por las horas de estudio, las salidas, las peñas, por su compañerismo y amistad invaluable. Son personas que siempre están presentes. Gracias BlanKis, Caro, Cin, Eve, Gise, Lucia, Lulianita, Vicky, Lea, Lolo, Nico, Joseph, Juli, Seba y Walter. ¡¡LOS QUIERO MUCHO A TODOS!!

A todos los chicos del IBAM por los momentos, las risas, sus consejos, compañerismo y ayuda. ¡Gracias a todos!

A mis socios Sabrina y Renato por sus enseñanzas, tiempo, compañía, ayuda e innumerables favores. Y a Bocha por su generosidad.

A mis amigas Ceci, Romi, Noe, Selva y Cele por su apoyo y preocupación.

A la Universidad Nacional de San Luis y a todos sus docentes por sus enseñanzas y calidad humana.

Al Dr. Bottini por permitirme desarrollar mi tesis en la Cátedra a su cargo. Y a los chicos de Orgánica por sus consejos.
A todos los que siempre están ¡¡MUCHAS GRACIAS!!
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