Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Teoretyczne i praktyczne aspekty zjawiska interferencji RNA

Enjoy !
by

edyta pawik

on 27 October 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Teoretyczne i praktyczne aspekty zjawiska interferencji RNA

Teoretyczne
i praktyczne aspekty zjawiska interferencji RNA

Struktura kompleksu RISC

RISC (ang. RNA-induced silencing complex) - kompleks zbudowany z białek i RNA, który bierze udział w wyciszaniu ekspresji genu w procesie interferencji RNA (RNAi).


Interferencja RNA
WYKORZYSTANIE INTERFERENCJI RNA DLA CELÓW TERAPEUTYCZNYCH
Odkrycie zjawiska interferencji ożywiło świat biotechnologii, medycyny i farmacji.
Zrewitalizowało dotychczas stosowane technologie terapeutyczne oparte na syntetycznych fragmentach kwasów nukleinowych.
Zauważono, że siRNA wyciszają geny związane z patogenezą chorób.
Inhibicja ekspresji genów jest specyficzna i nie powoduje skutków ubocznych ze strony układu immunologicznego.
W 2003 roku po raz pierwszy zastosowano w terapii żółtaczki wątrobowej myszy.
Rok później zatwierdzono w USA pierwsze kliniczne próby z użyciem interferencyjnych RNA.
CHOROBY NOWOTWOROWE
Rola interferencji w diagnozowaniu nowotworów
Badania wykazały odmienne poziomy ekspresji miRNA
w komórkach nowotworowych w porównaniu z ekspresją
w komórkach prawidłowych.

Z czego to wynika?

Prawdopodobnie z umiejscowienia genów miRNA w tzw: miejscach łamliwych (fra sides). Mimo to, w większości przypadków nie są znane mechanizmy prowadzące do zaburzeń syntezy miRNA. Wpływ mogą mieć zmiany epigenetyczne oraz defekty związane z dojrzewaniem miRNA.

Profil ekspresji miRNA
Stosowany:
podczas diagnozowania, monitorowania oraz odpowiedzi chorego na zastosowany rodzaj terapii,

jako marker ważnych cech histopatologicznych takich jako zdolność do przerzutowania i angiogenezy oraz stadium nowotworu.

Najlepiej poznano miR-15 i mR-16
Geny tych miRNA są umiejscowione na chromosomie 13,
W regionie podlegającym delecji w przebiegu większości przewlekłych białaczek limfocytowych B-komórkowych wykazano, że miR-15a i miR-16-1 pełnią funkcję negatywnych regulatorów genu BCL-2.

Nowotwór płuc a let-7 miRNA
Doświadczenie przeprowadzone in vitro:
nadekspresja let-7 miRNA w komórkach linii A549 gruczolakoraków płuc znacznie hamowała proliferację.

Wykazano udział let-7 miRNA w negatywnej regulacji onkogenów ras i myc (onkogenów w raku płuc).

Prawdopodobnie let-7 miRNA bierze udział w regulacji kinazy LIM należącej do enzymów modulujących kształt i mobilność komórek.

Nowotwór płuc a miR 17-92
Ekspresja policistronowego skupiska miR 17-92 przyśpiesza rozwój nowotworu płuc (typ drobnokomórkowy),
Związane jest to z położeniem na 13 chromosomie locus, które często podlega amplifikacji m.in. w chłoniakach B-komórkowych.

Problemy w leczeniu chorób nowotworowych
Głównym problemem jest oporność komórek na apoptozę (niemożność zastosowania chemioterapeutyków).

Dlaczego tak się dzieje ?
Dzięki mechanizmom angażowania nadekspresji białek antyapoptotycznych (Bcl-2 lub IAP)

Interferencja umożliwiła efektywne wyciszenie genu glikoproteiny P odgrywającej rolę w nabywaniu przez komórkę nowotworową oporności wielolekowej. Obserwuje się to w wielu typach nowotworów.

W terapii problem stanowi selektywność leku w stosunku do komórek rakowych, przy niskiej toksyczności w stosunku do komórek prawidłowych.

Z pomocą przychodzi terapia genowa.
Terapie przeciwnowotworowe są skupione na :

onkogenach (cząsteczka siRNA wycisza gen bcr-abl)

geny ras i p53 (30% nowotworów ma mutację punktową)

Interferencja RNA a geny pośredniczące
w kontroli cyklu komórkowego
Zaburzenia powodują immortalizację komórek, np.:
białko Skp-2 (podjednostka kompleksu ligazy ubikwitynowej negatywnie regulującej poziom białka p27 Kip1 zaangażowanego w punkcie G1/S)

Wyciszenie genu kodującego białko Skp-2 wpływało na wzrost ekspresji genu p27 Kip1, co przyczyniło się do zahamowania rozwoju guza nowotworowego
Terapie RNAi
skutecznie podwyższają efekt terapeutyczny klasycznych leków np; daunorubicyny;
skierowanie siRNA na mRNA białka MDR1, którego supresja zwiększa podatność komórek rakowych na chemioterapię,
w badaniach nad kontrolą procesu angiogenezy,

wyciszenie genu czynnika wzrostu naczyń śródbłonka (VEGF) na wzrost guza prostaty,
wyciszenie ekspresji receptora adenozyny A1 (rak sutka),
zastosowanie siRNA na komórki gruczolaka Barretta, indukcja apoptozy,

STANY ZAPALNE
Stany zapalne
występowanie nadekspresji czynnika nekrozy nowotworów (TNF-alfa) w:
-reumatoidalnym zapaleniu stawów,
-sepsie,
aktywność siRNA skierowanego na gen fas (zapalenie wątroby),
aktywność siRNA specyficznego dla mRNA kaspazy 8 (ostra niewidylność wątroby),

INFEKCJE WIRUSOWE
Infekcje wirusowe
Hamowanie replikacji:
-wirusa HIV,
-wirusa zapalenia wątroby typu B i typu C,
-wirusa polio,
-rotawirusów i adenowirusów.

Terapie skierowane na wirusowe RNA i mRNA białek gospodarza:
Terapia anty-HIV : siRNA skierowane na mRNA receptorów CD4 i/lub jednego z koreceptorów CCR5 i CXCR4.
Okazało się, że wirus ma zdolność modulacji mechanizmu RNA interferencji poprzez wpływ na poziom białka TRBP, co znacznie utrudnia zahamowanie jego replikacji.

….wirus HIV-1
Na transgenicznych myszach z przeszczepionym ludzkim szpikiem kostnym zaobserwowano, że można kontrolować replikację wirusa a tym samym utratę limfocytów T CD4+.

Istnieje przypuszczenie, że takie leki mogłyby wpływać na infekcje u ludzi.

Geny kodujące białka :
strukturalne (Gag i Env),
regulatorowe (Tat i Rev),
pomocnicze (Nef i Vif),
odwrotną transkryptazę Pol,
W terapii sugeruje się jednoczesna ekspresję kilku różnych antywirusowych siRNA kodowanych w shRNA.

Wirus zapalania wątroby (HCV)
Mimo licznych komplikacji w potranskrypcyjnym wyciszaniu ekspresji genu, związanych z aktywnością mutacyjną, region 5’UTR odznacza się wysoką konserwatywnością.
siRNA skierowane przeciw sekwencjom IRES hamowały replikację genotypów HCV.

Wirus grypy
Ma zdolność do ciągłego mutowania, co skłania do ciągłego poszukiwania lekó antywirusowych,
siRNA skierowane przeciwko transkryptowi wysoce konserwatywnego wirusowego genu M2 długotrwale hamowało replikację w obrębie podtypów H i H1.

Wirus brodawczaka człowieka
Badania Yamato i współpracowników przeciwko onkogenom E6 i E7, stosujących swoiste siRNA wykazały zahamowanie wzrostu linii komórkowych nowotworów szyjki macicy.

W kilku badaniach udało się efektywnie dostarczyć siRNA poprzez wkraplanie donosowe na modelu zwierzęcym
Kluczową rolę w mukowiscydozie odgrywa nadmiernie aktywne białko VCP/pr97 , które indukuje zniszczenie transporterów chlorkowych (CFTR) u chorych.

Mukowiscydoza
W celiakii dochodzi do wytworzenia nieprawidłowej odpowiedzii limfocytów T na dostarczane w diecie białko – gluten.
Po połączeniu z tkanową transglutaminazą (tTG), gluten ulega modyfikacji, co doprowadza do powstania kompleksów immunogennych, wywołujących odpowiedź zapalną zależną od limfocytów T.
RNAi w chrobie trzewnej (celiakia)
FDA wyraziła zgodę na przeprowadzenia badań klinicznych z użyciem siRNA przeciwko mRNA VEGF ( czynnik wzrostu śródbłonka naczyń) w celu zablokowania angiogenezy u chorych na zależne od wieku zwyrodnienie plamki żółtej (AMD).
Pierwsze badania kliniczne dot. terapeutycznego zastosowania RNAi
Literatura:
http://fpn.ipin.edu.pl/aktualne/2008/1/t24z1_2.pdf
http://wmil.home.pl/rocznik/files/138_147_rocznik_piotrowska.pdf
„ Zastosowanie interferencji RNA w diagnostyce i tersapii niektórych chorób człowieka” P. Józwiak, A. Lipińska
Flexibility of Dicer studied by implicit solvent molecular dynamics simulations.
https://hpc.man.poznan.pl/modules/kdm_training/uploads/konferencja-uzytkownik-ow-kdm-2009/Sarzynska.pdf
Rodzaje RNA
matrycowe RNA (mRNA)
rybosomalne RNA (rRNA)
transferowe RNA (tRNA)
heterogenne jądrowe RNA (hnRNA lub pre-mRNA)
antysensowne RNA albo interferencyjne RNA (siRNA i miRNA)
małe cytoplazmatyczne RNA (scRNA)
małe jądrowe RNA (snRNA)
małe jąderkowe RNA (snoRNA)
Centralny dogmat biologii molekularnej
Wolno żyjący, niepasożytniczy nicień, organizm modelowy (1998)

Wyciszenie ekspresji genów, poprzez blokowanie translacji.

Kompleks mRNA endogennego i siRNA egzogennego.
Interferencja RNA
Mechanizm
siRNA i shRNA
Rybonukleaza Dicer
Rybonukleaza Dicer bierze udział w cięciu dwuniciowego RNA na krótkie kawałki (21-25 par zasad)

Składniki kompleksu RISC – białka z rodziny Argonaute
Ago2 – wywoływanie zjawiska RNAi
Domeny PAZ i PIWI
Domeny PAZ z kieszenią wiążącą dwunukleotydowe, 3` - końcowe fragmenty RNA
Domeny PIWI z centrum katalitycznym o budowie przestrzennej (typowe dla RNazy H)


http://helicase.pbworks.com/w/page/17605619/Emily-Devol

Schemat wiązania siRNA do kompleksu RISC
http://fpn.ipin.edu.pl/aktualne/2008/1/t24z1_2.pdf
Wektory wirusowe
Retrowirusy
Lentiwirusy
Adenowirusy
Parwowirusy
Wirus opryszczki typu pierwszego

Wirus opryszczki
http://zdrowie.gazeta.pl/Zdrowie/0,0.html

Wirus HIV
http://zdrowie.dziennik.pl/aktualnosci/artykuly/326793,wirus-hiv-niestraszny-ludziom-odpornym-na-aids.html
Adenowirus
Wektory wirusowe
Wirus opryszczki
Immunogenny
Cytotoksyczny

Parwowirusy

Niektóre nie wywołują odpowiedzi układu immunologicznego
Problematyczne utrzymanie wysokiego miana AAV w hodowli in vitro


Lentiwirusy
Najlepsze wektory pozwalające na stabilną ekspresję iRNA
Integracja z genomem gospodarza w miejscu odległym od promotorów (ograniczona onkogenność)

Retrowirusy

Genom - jednoniciowy RNA
Po infekcji – odwrotna transkrypcja i integracja z genomem gospodarza
Inaktywowane w surowicy przez białko c1 dopełniacza


Wektory niewirusowe
W przypadku RNAi do najczęściej stosowanych nośników należą kationowe polimery i liposomy. Tworzy się kompleksy siRNA z komponentami o ładunku dodatnim. Nośniki są opłaszczane zazwyczaj hydrofilowymi polimerami, w celu uniknięcia opsonizacji białkami osocza.

PEG – glikol polietylenowy, jeden z najczęściej stosowanych polimerów opłaszczających nośniki
SNALPs – kationowe lipidy stabilizowane przez PEG (stosowane podczas dostarczania siRNA w celu wyciszenia genu apolipoproteiny B – apoB u myszy i naczelnych.

Wada PEG: spadek wnikania kompleksów do komórek

Rozwój nowych strategii
Produkcja nośników oparta na zastosowaniu ligandów (galaktoza, LDL, transferryna, fragmenty przeciwciał) – przyłączanie do swoistych typów komórek z odpowiednimi receptorami.

Włączanie transfekowanego siRNA do cytoplazmatycznego kompleksu RISC – rozpad nośnika i opuszczenie endosomu przez siRNA.
Wektory niewirusowe

Zachowuje się jak gąbka protonowa – napływ protonów i wody do endosomu, pęcznienie endosomu i jego liza, uwolnienie kompleksu siRNA do cytoplazmy.


PEI (polyethylene imine)
http://en.wikipedia.org/wiki/Polyethylenimine
choroba Parkinsona
choroba Huntingtona (HD)
zespół łamliwego chromosomu X
stawardnienie zanikowe boczne (ALS)
zanik mięśni
Choroby neurologiczne
Zidentyfikowano aktywne cząstki siRNA zdolne do hamowania ekspresji genu beta- sekretazy uczestniczącej w wydalaniu beta amyloid.
Ten krótki peptyd jest głównym składnikiem płytek amyloidowych zidentyfikowanych w mozgach (region hipokampa i kory mózgowej) pacjentów z chorobą Alzheimera.
Full transcript