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DNA-Analyse

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by

Philipp Kloza

on 7 January 2014

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Transcript of DNA-Analyse

DNA-Analyse
Agarosegel
Elektrophorese
Hybridisierung
- Sekundärtemperatur auf 50°C
- Zugabe von komplementären Primern, die sich an die einzelnen DNA-Stränge binden (Anfangssequenz muss deshalb bekannt sein)

Polymerisation
- Synthese des komplementären Strangs durch DNA-Polymerase in 3'-5'-Richtung vom Primer aus
- Verwendung von taq-Polymerase (--> Thermus aquaticus), da diese sehr hitzebeständig ist

Denaturierung
- erhitzen der DNA auf 90°C
- Auflösung der Wasserstoffbrücken
- Trennung der beiden Stränge
30x
Vorbereitung der Proben
- Auftrennung der Probe auf vier Reagenzgläser
- DNA-Nukleosidtriphosphate dGTP (G), dATP (A), dTTP (T) und dCTP (C) werden großzügig dazugegeben
- in jedes Reagenzglas wird eine geringe Menge der modifizierten Stopp-Desoxyribonukleosidtriphosphate ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP hinzugegeben
Versuchsablauf
- DNA-Polymerasen katalysieren in 5'-3'-Richtung die Synthese der komplementären Stränge
- Polymerase baut zufällig normale und Stopp-Nukleotide in den DNA-Strang ein:
--> wenn ein Stopp-Nukleotid eingebaut wird...
--> wenn ein normales Nukleotid eingebaut
wird...
- in jedem Ansatz bilden sich also unterschiedlich lange DNA-Stränge
Denaturierung
- DNA-Stränge werden auf 94°C erhitzt und in Einzelstränge getrennt

Hybridisierung
- an die DNA-Fragmente docken radioaktiv markierte Primer
DNA- Sequenzierung
Danke für eure Aufmerksamkeit!
Quellen
wikipedia.de
Biologie Oberstufe, Cornelsen Verlag


www.youtube.com/watch?v=aZvFFsXgKIo
- Ziel: DNA Fragmente nach Länge aufgetrennt
- aufgegossene Agarose bildet molekulare Netzstruktur als Trägermedium
- DNA Probe wird in Probetasche aufgetragen
- Anlegung eines Minus- und Plus-Poles
- DNA (negativ geladen) bewegt sich aufgrund Eigenladung zum positiven Pol (kleine Fragmente wandern weiter als große Fragmente)
Durch Vergleich mit Längenstandard (=Standardmischung bekannter Fragmentlänge) sind DNA Fragmente unbekannter Größe zuzuordnen
www.youtube.com/watch?v=wZ_JlYgaqdE
www.wissenschaft-online.de
Frederick Sanger
Philipp, Falko und Konstantin
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