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Polymerase Chain Reaction

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Eduardo Daniel Aguilar Solis

on 20 January 2016

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Transcript of Polymerase Chain Reaction

¿Que

es?

Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por el disidente bioquímico norteamericano Kary Mullis.
El objetivo principal es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular, partiendo de un stock mínimo. Su desarrollo inicia en "Cetus Corporation California", en la década de los 80's.
Aplicaciones
Su utilidad real viene durante (qPCR) o tras la amplificación del material genético, logrando así que podamos.
- Identificar virus, bacterias o parásitos causantes de una enfermedad,
- Diagnostico de posibles enfermedades hereditarias
- Pruebas de efecto de fármacos o compuestos en genes específicos ligados a ciertas enfermedades
- En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos
- Clonación de ADN para secuenciación
- Análisis Filogenéticos
- Identificación de huellas genéticas
Polimerasas
Las polimerasas son enzimas capaces de replicar ácidos nucleicos.
Resultan cruciales en la división y transcripción celular

En la PCR, la DNA polimerasa reconoce una base desoxirribononucleótica no apareada de la cadena parental y la combina por medio de su único sitio activo con un desoxirribonucleótido tri fosfato (dNTP) libre que tenga la base complementaria correcta (A-T G-C) a una taza calculada de 1000 nucleótidos por segundo. A continuación, la DNA polimerasa cataliza la formación de nuevos enlaces covalentes que ligan el fosfato del nucleótido nuevo con el azúcar del nucleótido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento.
Aguilar Solis Eduardo Daniel
Polymerase Chain Reaction
PCR
La técnica introdujo una revolución en la investigación biológica, biotecnologica y médica, lo cual le hizo merecedor del premio Nobel de Química de 1993
Fundamento
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN.

Conociendo esto se emplean ciclos de altas y no muy altas temperaturas alternadas para separar las hebras, unir fragmentos cortos (Primers) y completar las cadenas de ADN recién formadas
En sus primeras etapas de desarrollo, la técnica tuvo un progreso bastante lento, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura necesarios para la Hibridación - Alineamiento - Extensión (1 Ciclo)
y era necesario agregar nuevas polimerasas a cada ciclo.
Principalmente la desnaturalización de las polimerasas ocurría durante la primera fase del ciclo a la temperatura de 95 °C .
Además no existía un aparato que permitiera automatizar el proceso de calentamiento y enfriamiento de los tubos de reacción.
Esto ocasiono que se tuvieran que obtener nuevas series de polimerasas termoestables y la mejor manera de obtenerlas fue de microorganismos extremofilos adaptados a vivir a altas temperaturas, mas precisamente de Archeas.
Años de investigación produjeron 4 candidatos

Thermus aquaticus (Taq)
Pyrococcus furiosus (Pfu)
Thermococcus litoralis (Vent)
Thermus thermophilus (Tth)
Hoy en día todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.
Muchos termocicladores modernos hacen uso de un efecto llamado Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo corriente eléctrica.
Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción
Como hemos visto la PCR es una técnica de avanzada y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones, esto ha hecho que se convierta en una técnica muy extendida y por consiguiente con mucha tecnología en el equipo y reactivos necesarios para llevarla a cabo.
Según el "Cetus Corporation" creador y desarrollador de la técnica se tienen aceptados 18 subtipos de PCR.

PCR Especifica de alelo
PCR Assembly
PCR Asimétrica
PCR de Colonia
PCR Hot-Start
PCR Especifica de inconsecuencias
PCR Inversa
PCR Especifica de Metilación
PCR Múltiple de Sonda
PCR Cuantitativa
PCR Tail
PCR Touchdown
PCR PAN-AC
PCR Ciclo térmico rapido
PCR Anidada
PCR Extensión Solapada
PCR In situ
PCR con RT
La reacción fundamental es la unión del grupo fosfato al grupo 3'-OH y al del desoxirribonucleótido 5' de la cadena en crecimiento
La técnica en su momento ofreció innovación y muchas ventajas por las cuales se le hizo parte de la columna vertebral de la investigación mundial
Sensibilidad: Ya que solo se requería una cantidad mínima de ADN para producir la amplificación.

Especificidad: Ya que la obtención de un solo producto amplificado era determinada por los primers y la especificidad con la que se unieran al ADN molde, minimizando falsos positivos.

Eficiencia: Ya que se puede obtener miles de millones de amplificados en un número determinado de ciclos.

Fidelidad: Ya que los errores que comete la ADN polimerasa son mínimos.
"La idea de que podamos hacer billones de copias de la información genética de una personas a partir de una única molécula molde de ADN en una tarde de verano, nos coloca en una posición aun mas ventajosa para curar enfermedades que la del mismo Dios"
Kary Mullis (1993)
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura, las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad del tipo de PCR que sea y los reactivos usados .
En general, independientemente del tipo de PCR que sea, se suelen usar de base los siguientes reactivos:

* Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

* Dos cebadores, iniciadores, primers u oligonucleótidos que deben ser complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

* Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente que actúa como cofactor que une las subunidades componentes de la polimerasa y le da estabilidad de carga para poder trabajar sobre la hebra de adn.

*Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

* ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

*ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar hidratada con agua libre de contaminantes

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN. Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. Pero todos necesitan romper los puentes de hidrógeno formados entre ambas hebras
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C dependiendo la TM del primer, de hecho todos los primers están diseñados para que puedan formar puentes de hidrógeno y enlaces fosfodiester de una manera mas rapida permitiendo así el alineamiento.
Además Todas las ADN polimerasas conocidas sintetizan el ADN en la dirección 5' a 3'. Ella sólo puede añadir un nucleótido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta razón la ADN polimerasa necesita un cebador al grupo 3' -OH para del cual puede añadir el primer nucleótido. Así mismo los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
Extensión o elongación de la cadena
Aquí es donde actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar las cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial para sintetizar el ADN target o amplificado.
La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
Ya en practica la PCR puede fallar debido a muchas cuestiones, principalmente la contaminación, la condensación de la reacción, mal manejo de pipetas, o un mal diseño de los primers por eso se deben extremar precauciones desde el momento en el que incluso se hacen las pruebas in silico para el diseño.
Algunas consideraciones al diseñar primers son:
-
Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos. Normalmente, se suelen diseñar de 20 nucleótidos.
-Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
-La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas.
-Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
-La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5 °C.
-Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.


Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Se recomiendan la taq y la pfu.
Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.
En realidad la técnica de PCR no tendría ningún sentido si nosotros no tuviéramos una manera de visualizar el amplificado si es que lo hay. Para resolver este problema se usa la Electroforesis en Gel de Agarosa.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel).
Se fundamenta en el hecho de que toda molécula esta cargada eléctricamente y este se moverá de acuerdo a su tamaño.
En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es inversamente proporcional a su tamaño
La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extraen de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica. Su tamaño de poro puede ser ajustable a la concentración, normalmente estas van desde 0.7% hasta 2%, obteniendo visualización de moleculas grandes con una concentración menor y de moléculas pequeñas con una concentración mayor. A una concentración de 1.5% el tamaño de poro da libre paso a moléculas desde 0.2 a 1 Kb. Normalmente el tamaño del amplificado de una PCR es de 0.6KB, mientras que el tamaño de un ARNm es de 1.8 a 2.2 Kb
Condiciones por reacción para GO TAQ Polimerasa Promega
Buffer Green Reaction 5X a 0.75mM
DNTPs a 10mM
Primer 1 1mM
Primer 2 1mM
GoTaq 1.25U
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