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Principios básicos de la Técnica Histológica y Microscopio

Pasos y tecnicas histoquímicas
by

Diego Guerra

on 25 February 2013

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Transcript of Principios básicos de la Técnica Histológica y Microscopio

PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA TÉCNICA HISTOLÓGICA Y MICROSCOPIO PROCESO HISTOLÓGICO Serie de métodos o técnicas para poder observar características de tejidos FIJACIÓN Preservar el tejido
Poder y velocidad de penetración
No producir artefactos
No dificultar el tratamiento posterior Tipos de fijadores Físicos: Desecación, calor seco, calor húmedo, frío congelación.
Químicos: Establece puentes entre moléculas. Fijadores Simples Alcohol etílico (deshidratación): Puede preservar enzimas, antígenos, glucógeno, pigmentos. se utiliza al 70-90%. No tiene efecto mordiente. Ácido acético (coloides-1-5%): Ideal para ácidos nucleicos y proteínas, destruyen mitocondrias y mala fijación de membranas. buen mordiente. estas sales pueden coagular las proteínas. buen lavado para una buena inclusión. Ácido Picrico (coloides-3%): buen mordiente. estas sales pueden coagular las proteínas. buen lavado para una buena inclusión. Formaldehido (proteínas tubulares-4%): Buen observación de estructuras celulares pero muy baja penetración tisular. Glutaraldehido (puentes): IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN Congelación Inclusión Consiste en infiltrar la muestra en sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican. Esto con la finalidad de obtener cortes histológicos delgados y uniformes. Parafina Como la Parafina no es soluble en agua, es necesario primero extraer el agua tisular (DESHIDRATACIÓN), por medio de una sustancia soluble en agua y en el Xilol (sustancia solvente de la parafina), está sustancia es el alcohol, y luego sustituir el alcohol por el Xilol (ACLARAMIENTO). Resina Epoxi, Metacrilato. El endurecimiento de la resina no es por enfriamiento si no por polimerización Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra o tipo de tejido Corte Microtomo Parafina: Congelamiento: 5-20 micrómetros. observación por microscopio óptico 30-100 micrómetros Preparación del bloque de parafina antes de iniciar la obtención de secciones útiles Instrumento destinado a realizar cortes histológicos lo suficientemente delgados, que permitan la penetración de los reactivos utilizados para colorearlos y dejen pasar la luz para poder ser observados al Microscopio.
Contiene cuchilla, base o portabloques y un sistema mecánico que permite acercar el bloque a la cuchilla. Y después... Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que serán colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 °C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos. Piramide truncada Eliminación del espesor de parafina que hay entre la superficie del bloque 40ºC gelatina, Albumina Microtomo de rotación Microtomo por deslizamiento Vibratomo de 40-50 micrometros Obtiene cortes gruesos sin necesidad de inclusión Movimiento vibratorio latera (modo sierra)
Cortes en flotación (visualización rápida) Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra o tipo de tejido Muestra blanda, proceso de secado Inconvenientes: Vista lateral de la cubeta de un vibratomo. Pegado de la muestra al bloque portamuestras. Criotomos de 10-30 micrómetros Obtiene cortes mas rápidos sin necesidad de fijación Congela la base que soporta la muestra (gas carbonico) de -30-40ºC.
Adhesión al portamuestras por contacto Microtomo de congelación. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 °C, lo cual congela a su vez a la muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en tampón de trabajo. Criostato. Microtomo Encerrado por cámara refrigerada (10-30ºC).
El portamuestra se encuentra a 50ºC (unido por pegamento).
La muestra se une a la lámina por contacto. Criostato El mecanismo de rotación y corte del criostato se encuentra dentro de una cámara refrigerada. Cortes histologicos por congelación. Ultramicrotomo Cortes en nanometros. Uso para microscopio electronico. Totalmente mecanizado Resina Epoxi.
La muestra se une por contacto a la lámina Ultramicrotomo Ubicarse en un lugar donde no halla vibraciones ni cambios de Tº (dilatación del brazo). Precauciones: Es necesario retallar y devastar. Superficie de corte: 0.5mm2 Observación/Microscopio Imágenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en las imágenes) al observar un epitelio estratificado plano queratinizado. Microscopio Electrónico Observa ultraestructura celular.
> poder de resolución: 1 nanómetro (Haz de electrones).
Emplea no lentes si no imanes (concentra los electrones por el filamento)
Longitud de onda del haz de electrones 2000 veces menor que la del haz de luz Comparativa de la composición básica de un microscopio óptico (izquierda), electrónico de transmisión (centro) y electrónico de barrido (derecha). Microscopio Electrónico
de Trasmisión Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz
Muestras 3 a 4 veces mas delgadas
Permite visualizar partículas de tamaño menor que la longitud de onda de la luz visible
Emplea un filamento de tugsteno, los electrones se condensan por los imanes y se focalizan en una sección del tejido.
Muestra tratada con metales pesados (blanco y negro): Coloreado (revota en el tejido -oscuro-), no teñido (revota en la placa la cual genera un haz luminoso). Ultramicrotomo Imágenes tomadas en con microscopio electrónico de transmisión. Se puede ver la capacidad de estos microscopios observando el incremento de resolución de las imágenes de izquierda a derecha. Las líneas negras de la imagen de la derecha corresponden a las membranas celulare Observa superficies celulares Los electrones reaccionan con su superficie. Se cubre la muestra para formar un releve. El haz de electrones no atraviesa la muestra sino que la explora (La barre). Proporciona características superficiales de materiales orgánicos o inorgánicos. Imágenes obtenidas con un microscopio electrónico de barrido. Muestran el interior del canal central de una médula espinal de lamprea. Se pueden observar numerosos cilios (con más detalle en B) y pequeñas microvellosidades en los dominios apicales de las células que forman las paredes de dicho canal. Microscopio
Electrónico de Barrido Imágenes obtenidas con un microscopio electrónico de barrido de la superficie de una hoja de kiwi. Los estomas son claramente visibles destacando sobre las células epidérmicas (A). Las células oclusivas, dependiendo de la turgencia, pueden tener sus paredes celulares juntas, estoma cerrado (B), o separadas, estomas abiertos (C). Tinción Aquellas que se unen por afinidad química. posee tres componentes: Un esqueleto incoloro o benceno. Un radical que aporta color o cromoforo. Un radical que permite la interacción con moléculas citoplasmáticas o auxocromo. Microscopio Cofocal Microscopio de Fluorescencia Lampara de mercurio (Luz UV). El rayo de luz excita los fotones en el tejido. Se usa en Tejidos y Células vivas. Combina componentes de un microscopio óptico de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra. Punto de barrido muy superficial. Elimina luz difusa de fluoroforos que están fuera del campo de enfoque. Imágenes de fluorescencia. A la izquierda, inmunocitoquímica para el neuropépido Y en cerebro de rata, utilizando el fluoróforo Texas-Red. A la derecha, motoneuronas en cerebro de lamprea marcadas con el trazador neuronal fluoresceína que es en sí mismo un fluoróforo. Cada uno de los fluoróforos se ha estimulado con frecuencias diferentes y lo que se observa es la emisión en el espectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y verde, respectivamente. Metacromasia: Cambia el color del colorante cuando interactúa con moléculas celulares. Ortocromasia: No cambia. Tinción Química Básicos: Cargado positivamente, se unen a componentes celulares cargados negativamente (Basófilos).
Tienen afinidad por sustancias ácidas como DNA y glucosaminoglicanos (catión). Tionina, safranina, azul de toluidina, azul de metileno, Hematoxilina. Ácidos: Cargados en forma negativa, se unen a compuestos celulares cargados positivamente (Acidófilos). Se unen a grupos aminos de las proteínas. El anión es coloreado y la base incolora. Fucsina, Naranja G o Eosina. Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina). Con porción ácida y básica que aportan color.Tiñe tanto partes básicas como ácidas Eosinato de azul de metileno. Neutros: Elementos que se disuelven en ellos pero no por su afinidad. Colorante sudan (disuelven lípidos). Indiferentes: Tinción semifinos Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda teñir el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina. Sección semifina de un glomérulo de un riñón obtenida a partir de una inclusión en resina y teñida con azul de toluidina. Histoquímica Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células caliciformes teñidas de rosado con la técnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tinción general aparecen transparentes, sin teñir. Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hemtaoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son los específicos para esta tinción. Modificación química con moléculas celulares Detección de hidratos de carbono (oxidación por á. periodico, y su detección por Schiff de aldehídos generados-coloración rojiza-) Histoquímica enzimática Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación, preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lípidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37°C y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. La concentración de los sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) varía según el tejido o el proceso de fijación. Reacción dada por la enzima blanco genera productos coloros.
Obtenidas por congelación o vibratomo. Imagen de un corte de 60 µm de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoquímica enzimática que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima óxido nítrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (células con un color azul intenso). Universidad Central de Venezuela
Facultad de Medicina - Escuela de Medicina “Luis Razetti”
Departamento de Ciencias Morfológicas
Cátedra de Histología y Embriología Normal Autoría:
Br. Guerra Bello Diego Enrique Todos los procedimientos destinados a obtener preparaciones histológicas constituyen la llamada
TÉCNICA HISTOLÓGICA Etapas para la Obtención de Preparados Histológicos 1 2 3 4 5 6 Histología Es la ciencia que se encarga del estudio morfológico y funcional de la célula y su agrupación en tejidos y órganos Anatomía Microscópica Una preparación histológica no es más que una rebanada muy delgada (corte histológico) de una pequeña parte de tejido corporal, colocado sobre una lámina porta-objeto, coloreada y cubierta por una lámina cubre-objeto. Conocimiento de la estructura microscópica del organismo para comprender los procesos bioquímicos y fisiológicos que en él tienen lugar Finalidad Diagnóstico de procesos patológicos Obtención del material Fijación Inclusión y elaboración del bloque de parafina
Deshidratación
Aclaramiento
Impregnación en parafina
Inclusión y elaboración del bloque de parafina Elaboración del corte de tejido y colocarlo sobre la lámina porta-objeto Coloración Medio de montaje y lámina cubre-objeto CARACTERÍSTICAS DE LOS TEJIDOS Son blandos
Ricos en agua
Se autolisan cuando son retirados de su irrigación ES NECESARIO HACER REBANADAS MUY DELGADAS Poder colorear el tejido
Permitir el paso de la luz y ser observado el tejido bajo el microscopio Por lo tanto se debe Fijar y Endurecer el Tejido Obtención del Material Biopsia Autopsia Bio Vida Opsia Ver Procedimiento diagnóstico que consiste en la extracción de una muestra de tejido para examinarla al microscopio.

Dependiendo si se extirpa la totalidad del órgano o lesión se dice que la biopsia es Excisional, y cuando solo se obtiene parte del órgano o de la lesión se dice que es Incisional Interrumpe el desarrollo de los procesos orgánicos, fijando y conservando de la forma más fidedigna posible el estado y la situación en que se encontraban los tejidos antes de separarlos de la irrigación Los fijadores actúan coagulando las sales proteicas de las células, endureciendo los geles e inactivando las enzimas Los tejidos deben ser colocados en un fijador con un volumen que sea 10 a 20 veces mayor que su volumen, por un periodo de 6 a 24 horas, tan pronto hayan sido extirpados Condiciones de un Fijador NO HAY UN FIJADOR UNIVERSAL!!! Sumergiendo un pequeño trozo de tejido en el fijador inmediatamente después de haber sido extraído. A esta técnica se la denomina fijación por inmersión. Formol (el más usado): Es de bajo Precio, fácil uso, buena preservación de los tejidos, actúa como conservante, produce poca retracción tisular y es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas.
Se utiliza en concentraciones que oscilan entre 4 y 10%.
Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares Propiedades de los Fijadores Producen una rápida muerte celular.
Preservan la morfología celular y tisular.
Preservan la composición química.
Penetran a los tejidos con relativa rapidez.
Facilitan la coloración posterior.
Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto, la putrefacción.
Aumentan la consistencia de los tejidos. Mezclas de fijadores Liquido Bouin(á.picrico-á.acetico-formaldehido): Empleada para inclusiones en parafina. Se dañan mitocondrias y el tiempo de exposición no debe excederse las 48 horas. Carnoy (á. acetico-Etanol-Cloroformo): Morfología nuclear, puede producir retracciones tisulares. Buen preservador de la ultraestructura celular.Alternante. Glutaraldehido-tetroxido de Osmio: Efectos indeseables de algunos fijadores Retraen los tejidos.
Precipitan en forma de cristales.
Endurecen demasiado las muestras.
Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas.
Producen alteraciones importantes a nivel molecular y/o ultraestructural. Una vez obtenida la muestra, para obtener el bloque, se coloca la misma en una rejilla con un gel especial, y a continuación se coloca en un micrótomo (criostato) el cual se encuentra en el interior de una cámara de congelación (temperatura -20°).
La ventaja de este método es que permite realizar el estudio de la muestra de forma casi inmediata del momento en que se obtuvo la misma, y poder realizar cortes más delgados. Liquida entre 40-70ºC. no soluble en agua. Previamente se somete a un proceso de deshidratación (de < a >%). Deshidratación: El tejido se sumerge en alcoholes de concentración creciente, hasta que el agua de la célula sea reemplazada por el alcohol. Aclaramiento: El tejido, después de estar impregnado en alcohol, se sumerge en Xilol hasta que el alcohol sea sustituido por éste Impregnación en Parafina: El tejido se coloca en Parafina fundida, hasta que el Xilol sea sustituido por ella. Inclusión en Bloque de Parafina: El tejido impregnado en la parafina se coloca el una caja (de metal o de papel) junto a parafina líquida, hasta llenar el envase. Se coloca el envase en una plancha fría o simplemente se deja a temperatura ambiente, consiguiendo así que la parafina pase a su estado sólido obteniéndose de esta manera el bloque de parafina. Aumentar el contraste de las estructuras biológicas, e identificar componentes mediante su afinidad tintorial. Cortes obtenidos por la técnica de la parafina, es necesario eliminar la parafina antes de colorear, ya que los colorantes son de base acuosa. Esto se logra colocando la lámina en la estufa de manera de que la parafina se ponga en estado líquido y luego en xilol. Una vez que hemos retirado la parafina, el corte es rico en xilol, y se procede entonces a rehidratar el corte, colocándolo en una batería de alcoholes de concentraciones decreciente, sustituyendo así el xilol por alcohol. Inmunohistoquímica Se fundamenta en la especificidad de la reacción entre un antígeno y un anticuerpo. Se basa en la detección de antígenos celulares a través de anticuerpos. Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por células del sistema inmunitario en respuesta a un antígeno. En este método se mezcla la técnica de antígeno anticuerpo con la propiedad que tienen algunos cuerpos de absorber longitudes de onda y luego emitir luz de una longitud de onda específica. Una vez obtenido el anticuerpo específico de lo que queremos identificar se procede a localizarlo por dos métodos: Inmunofluorescencia Directa Consiste en marcar al anticuerpo con fluorocromo y ponerlo en contacto con la muestra en estudio. Tiene la desventaja de que la intensidad de la señal que emite es muy baja. Inmunofluorescencia Indirecta Tiene mayor sensibilidad que los métodos directos. En este método se genera un anticuerpo (anticuerpo secundario) contra el anticuerpo (anticuerpo primario) de lo que queremos identificar.
El anticuerpo secundario se conjga con el fluocromo. Instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y permite ver mayores detalles de lo que seria posible a simple vista. Microscopio Simples: Una sola lente
Compuestos: Dos o mas lentes Clasificación: Campo Claro
Campo Oscuro
Contraste de Fase
Fluorescencia
Confocal
Luz Polarizada

Transmisión
Barrido Electrónico: Fotónico o de Luz: Microscopios Compuestos Microscopios Compuestos de luz Campo Claro Parte Óptica: Parte Mecánica: Encargada de la Iluminación y el Aumento
Ocular
Objetivo
Condensador
Fuente de Luz

Soporte adecuado a los diferentes elementos ópticos y a la muestra que se examina
Tubo
Columna
Pie
Revolver
Platina
Tornillos Macro y Micrométrico Parte Óptica Ocular Cilindro hueco, con un lente convergente en cada extremo y entre ambos existe un diafragma. Función: Tipos: Ampliar la imagen real e invertida dada por el objetivo.

5 X y 10 X Parte Óptica Objetivo Es la parte esencial del Microscopio
Tubo Metálico con varias lentes
Función: Aumentar el Objeto y proyectarlo sobre el ocular
Tipos:
-Secos: 5X, 10X, 25X, 40X
-Húmedos: 100 X Número de Aumento:
5X, 10X, 25X, 40X, 100X
Medio de Inmersión:
Secos y Húmedos
Distancia Mecánica:
Indica la longitud máxima del tubo en el cual se utiliza el objetivo.
Espesor del Cubre-Objeto:
Expresa en mm el máximo grosor del cubre-objeto.
Poder de Resolución:
Capacidad de una lente o sistema óptico de producir imágenes
separadas de objetos que están muy cerca uno del otro. Datos: Sistema Óptico
Longitud de Onda
Espesor de la muestra
Calidad de Fijación
Intensidad de Coloración Parte Óptica Condensador Grupo de lentes Convergentes que condensan el rayo de luz sobre la preparación Parte Óptica Fuente de Luz Ilumina la Muestra Parte Mecánica Tubo Cilindro metálico, cuyo interior se encuentra pintado de negro, para evitar reflexión de luz Parte Mecánica Columna Vástago vertical Parte Mecánica Pie Soporte del Instrumento y brinda Apoyo y estabilidad Parte Mecánica Revolver Pieza giratoria en el cual se atornillan los objetivos de diferentes aumentos Parte Mecánica Platina Pieza plana, con orificio central para permitir el paso del rayo de luz.
Sobre ella descansa el material a estudiar. Parte Mecánica Tornillos Macrométrico Movimientos rápidos para buscar punto aproximado de enfoque Micrométrico Movimientos lentos para obtener enfoque exacto Macrométrico Micrométrico Usos Células
Microorganismos
Tejidos Cilios Usos Geología
Odontología
Metalúrgica
Morfología
Medicina
Control de Calidad Industrial Microvellosidad Espermatozoides sobre la superficie de un ovulo Eritrocitos Microscopio de Contraste de Fase Se basa en el diferente índice de refracción al atravesar la luz del tejido.
Se utiliza en Tejidos y Células vivas y en objetos transparentes no teñidos. Microscopio de Campo Oscuro Proyecta luz refractada por la estructura en estudio.
Contorno de Bacterias y su movilidad Microscopio de luz Ultravioleta Depende de la absorción de la luz UV por las moléculas de la muestra.
Los resultados se registran en una placa fotográfica.
Permite detectar Ácidos Nucleicos. GRACIAS POR SU ATENCIÓN
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