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tecnicas de siembra

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Andrea Bernal

on 26 May 2014

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TÉCNICAS DE SIEMBRA

CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DE MUESTRAS AMBIENTALES

BIOPELICULAS DE APLICACIÓN MICROBIANA Y BIOTECNOLÓGICA

INTERACCIONES ENTRE MICROORGANISMOS DE INTERÉS AMBIENTAL BENÉFICO Y PATÓGENO

Cultivo en medio solido

Se conoce como cultivo en medio solido al que se hace en una caja Petri o tubo de ensayo con medio solido inclinado.

SIEMBRA POR ESTRÍA MASIVA
SIEMBRA POR AGOTAMIENTO, ASILAMIENTO DE ESTRÍAS CRUZADA
Función: es un buen método para el aislamiento de colonias; mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo.

SIEMBRA EN CUADRANTES
Función: el objetivo de esta técnica es diluir el inoculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar.
SIEMBRA DE PUNCIÓN
Función: es utilizado para observar el crecimiento de hongos y así mas adelante establecer su morfología; así como, para la trasferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y/o conservadas.

SIEMBRA POR INMERSIÓN
Se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido.


Función: Este método se utiliza para microorganismos aerobios.

SIEMBRA EN DOBLE CAPA

se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.).

Función: Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.

SUPERFICIE
SIEMBRA EN MASA

Primero se añade un volumen conocido de suspensión de microorganismos en una placa estéril; después se añaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45ºc, se mezcla el contenido de la placa con movimientos y se deja solidificar.

SIEMBRA EN TUBOS POR ESTRÍA SIMPLE

Se realiza en un tubo con medio solido inclinado y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estrías.


Función: este método es utilizado para obtener un gran número de microorganismo (incremento de inoculo) en la superficie de un agar.
Función: Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

La siembra de medios contenidos en tubo requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés.

TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBO
SIEMBRA MIXTA EN TUBOS
Se realiza sobre medios inclinados, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie inclinada marcando las estrias; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo.
Se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa argollada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo.

SIEMBRA EN TUBOS POR PICADURA
SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LIQUIDO

Para trasferir material a partir de un medio liquido o solido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica o en algunos casos, pipetas estériles o hisopos. Si se utiliza asas bacteriológicas, inocule el microorganismo en el medio liquido haciéndola rotar del mango.

SIEMBRA EN DILUCIONES EN SERIE


Cultivo e identificación de microorganismos de muestras ambientales
Como las superficies o líquidos muestreados son o pueden contener sustancias antimicrobianas, es necesario neutralizar su acción para que no inhiban el desarrollo bacteriano
Para ello, se usan sustancias neutralizantes que son distintas para casa desinfectante. Se utiliza aquí la siguiente combinación:
tiosulfato de sodio 0,5%,
lecitina 0,07%,
polisorbato 0,5%.
SUPERFICIE

Existen cuatro métodos para muestreo microbiológico de superficies:
a) Contacto directo con el agar (place RODAC)

b) Enjuague y desprendimiento (de bacterias adheridas).

c) Hisopado y siembra directa.

d) laminocultivos.

El método de contacto directo del agar con los microorganismos que se multiplican (RODAC=replícate organisms direct agar contact) utiliza placas Petri especiales y se usa medio de cultivo TSA o diferentes medios selectivos a conveniencia.
Consiste en frotar sobre un área conocida de las superficies a muestrear con un hisopos estériles empapados en solución buffer fosfato con neutralizantes y rotar luego los mismos sobre la placa de agar
1 PASO
Se añade a una placa de Rodac, un medio de cultivo sólido, en ligero exceso, para que la superficie quede convexa.
3 PASO
Cerrar e invertir la placa para su incubación, a temperatura y tiempo adecuado según el medio y determinación realizada.
2 PASO
La placa se coloca sobre la superficie a muestrear de una forma directa, manteniéndola inmóvil y presionando.
Es utilizado para muestrear objetos, instrumental y otros elementos pequeños
1 paso
se introducen en una bolsa de polietileno de 5 litros de capacidad que contienen un volumen de entre 50 y 100 ml de solución fisiológica estéril con neutralizador, como liquido de lavado
3 paso
A partir del líquido de lavado que contiene las bacterias desprendidas del objeto, se efectúa las siembras en profundidad de alícuotas de 1 y 0,1 ml en un agar con neutralizador.
2 paso
Una vez introducido el objeto a muestrear, se produce a agitar enérgicamente la bolsa a fin de desprender los microorganismos.
PARA MUESTRAS LIQUIDAS
PARA MUESTRAS EN SUPERFICIE
1 paso
Sacar la lamino cultivo del tubo sin tocar la superficie del agar.
2 paso
Sumergir el laminocultivo totalmente en el recipiente que contenga la muestra, durante un máximo de 5 segundos.
4 paso
Volver a meter el laminocultivo en su tubo y taparlo bien.
6 paso
Sacar el laminocultivo y comparar la densidad de las colonias crecidas con la siguiente tabla de patrón que indica la carga microbiana correspondiente por ml de muestra liquida.
3 paso

Dejar escurrir el exceso de muestra del medio de cultivo.

5 paso
Incubar en la estufa, en posición vertical, durante el tiempo y temperatura indicada.
Si el recuento obtenido es superior a 100.00 unidades formadas de colonias por ml, se recomienda repetir el proceso a partir de una dilución de la muestra en agua de peptona y luego multiplicar los resultados por el factor de dilución.
1 PASO
Sacar la lamino cultivo del tubo sin tocar la superficie del agar.
2 paso
Plegar la paleta del laminocultivo apoyando un dedo sobre el borde del extremo.
3 PASO
Apoyar el medio de cultivo nº1 sobre la superficie a muestrear, cuidando que el contacto sea total, ejerciendo una ligera presión pero sin desplazarlo.

Girar la laminocultivo y repetir el mismo procedimiento con el medio nº2. Muestrear e una superficie muy próxima a la anterior pero sin que coincida.
4 PASO
Volver a meter el manocultivo en su tubo y tapar bien.
5 PASO
Incubar en la estufa, en posición vertical, durante el tiempo y la temperatura indicada.
6 PASO
Sacar el laminocultivo y comparar la densidad de las colonias crecidas
Consiste en la exposición de placas de Petri al ambiente durante un cierto tiempo.

Este método tiene la ventaja de que se puede realizar en todas las condiciones habituales de trabajo y en tiempo real, es el más económico y requiere muy poco tiempo de dedicación.

SEDIMENTACIÓN
AMBIENTAL
Después de los periodos de incubación estipulados se realiza la lectura correspondiente:

Recuento de colonias, se efectúa cuadriculando la placa de petri y contando las colonias. Si no se obtienen colonias aisladas el recuento se informa como mayor a 300.

LECTURA DE RESULTADOS
Una vez leídos los recuentos, se registra la proporción de cada uno de los tipos de colonias y se procede a la identificación de los microorganismos predominantes.
Las pruebas iniciales efectuadas sobre las colonias son:

Morfología
Coloración de Gram
Determinación del tipo de metabolismo de hidratos de carbono
Pigmentación de la colonia
Presencia de enzima citocromo oxidasa

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
BIOPELÍCULAS
El término biopelícula (biofilm) hace referencia a una serie de microorganismos que se encuentran agregados en un exopolímero compuesto de glicocálix (75%) y que se organizan en forma de colonias adheridas a diferentes superficies, ya sean blandas, animadas e inanimadas.
BIOREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES
Las aguas residuales domésticas e industriales son ricas en materiales orgánicos y deben ser tratadas en alguna forma antes de devolverlos al ambiente.
BIOREMEDIACIÓN EN AGUAS CONTAMINADAS CON HIDROCARBUROS
Las bacterias oxidantes de los hidrocarburos son capaces de adherirse a las gotas insolubles de petróleo y de lograr la dispersión de la capa.
BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS SUBTERRÁNEAS
Para esto se han desarrollado las biobarreras que consisten en cúmulos de biopelÌculas que forman una barrera impermeable para el flujo del agua contaminada a otros sistemas.
EN EL BIOFILTRO
En el biofiltro las comunidades microbianas crecen sobre la superficie de un soporte por lo general de plástico, a través del cual pasa el aire contaminado. Los compuestos solubles en el gas entran en la biopelícula y quedan disponibles para su biodegradación, generándose productos no tóxicos.
biopelículas se pueden formar en diferentes tipos de superficies.

Dondequiera que haya una combinación de humedad, nutrientes y una superficie adecuada, es posible encontrar la formación de una
Biopelícula que provocan diversos daños y/o beneficios en dependencia del lugar en donde se encuentren.

Biopelícula formadas en una tubería (A), en
Una placa dental (B), en un arroyo (C) y en una
Membrana (D),


APLICACIONES
En muchos países como Colombia el residuo sólido del lodo que consiste en material no digerible y células bacterianas, se elimina periódicamente y se seca para ser utilizado como abono para la tierra.
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